第二节 细菌涂片制备及染色
细菌涂片的制作方法
细菌涂片的制作方法1. 概述细菌涂片是一种常用的实验技术，用于观察和研究微生物的形态、结构和特性。
制作细菌涂片需要注意一系列步骤，以确保样本的纯净性和有效性。
本文将介绍细菌涂片的制作方法。
2. 实验材料•细菌培养物•无菌平板•无菌吸管•无菌高温灭菌镊子•高温灭菌可打开的炉子或灭菌器•无菌的滴管或吸管•无菌的玻璃涂片•染色剂（如甲基蓝）•高倍显微镜3. 实验步骤步骤一：准备工作1.准备所需实验材料，并确保其无菌。
2.装好高温灭菌炉或灭菌器，并预热至适当温度（通常为121摄氏度）。
步骤二：取样1.使用无菌吸管将细菌培养物均匀悬浮。
2.使用无菌吸管采集适量的细菌培养物，并将其滴在无菌平板上。
步骤三：涂片1.使用无菌的玻璃涂片，在平板上均匀涂抹细菌培养物。
注意避免产生气泡。
2.在涂片上标记样本的信息，如细菌名称、日期等。
步骤四：高温灭菌1.使用无菌高温灭菌镊子夹住涂片的边缘。
2.将夹持的涂片通过高温灭菌炉或灭菌器中，快速闪过火焰。
步骤五：染色1.使用无菌滴管或吸管，在涂片上滴上染色剂，如甲基蓝。
2.等待适当时间，让染色剂充分渗透细菌。
步骤六：观察1.将涂片放到高倍显微镜下，用合适的放大倍数观察细菌。
2.注意观察细菌的形态、结构和染色情况。
4. 注意事项•所有操作必须在无菌条件下进行，以避免外来污染。
•在涂抹细菌培养物时要均匀涂抹，并避免产生气泡。
•在高温灭菌时要快速闪过火焰，以杀死细菌并保持样本的完整性。
•染色剂的使用要适当，避免过度染色影响观察结果。
•在观察细菌时，要选择适当的放大倍数和焦距，以确保清晰的观察图像。
5. 结论细菌涂片制作是一项基础实验技术，通过使用无菌技术和适当的染色方法，可以有效观察和研究细菌的特性。
良好的制作方法和注意事项能够提高细菌涂片的质量和可靠性，为后续的研究工作提供稳定可靠的实验基础。
以上就是细菌涂片的制作方法。
希望对您有所帮助！。
微生物常用实验3篇
微生物常用实验第一篇：细菌涂片染色实验细菌涂片染色实验是微生物学中最基本的实验之一。
通过染色方法，使细菌变得可见，便于观察形态、结构、数量等特征，有利于研究其生长、代谢、致病性等方面。
下面，我们来介绍细菌涂片染色实验的具体步骤：一、制备细菌涂片1.取出培养基上生长良好的细菌菌落，用不锈钢嵌片环沿中心点轻压一下。
2.将嵌片环中的菌落涂匀于无菌载玻片上，制备成直径约1厘米的薄片。
3.待载玻片上的细菌涂片晾干，并用火焰消毒。
二、涂片染色1.用火焰将铺有细菌涂片的玻片烤干。
2.将烤干的玻片浸入甲醇中，固定一分钟，再用水漱洗。
3.将玻片浸入碘酒中，固定一分钟，再用水漱洗。
4.将玻片浸入乙醇中，使背景颜色褪去，再用水漱洗。
5.将玻片浸入洋红染色液中，染色时间不超过1分钟。
6.用水冲洗干净，晾干后可以在显微镜下观察。
通过细菌涂片染色实验，我们可以直观地观察到细菌的形态、大小、聚集情况、颜色等，有助于鉴定细菌种类，并进一步深入研究其生物学特性。
第二篇：厌氧培养实验厌氧菌是一类生长需要在完全无氧条件下进行的微生物。
在许多疾病的发病机制中，厌氧菌都发挥着重要作用，因此，研究厌氧菌对于认识疾病的发病机制具有极其重要的意义。
下面，我们来介绍厌氧培养实验的具体步骤：一、制备厌氧培养基制备厌氧培养基是进行厌氧菌培养的关键。
具体操作步骤如下：1.准备培养基，并在其中加入培养菌株所需的配方和其他适宜的添加剂。
2.将培养基分装到无菌针筒或暗口瓶中。
3.在体积的一半至三分之二处加入去氧剂（一般为Thioglycolate或Dithiothreitol）。
二、厌氧细菌接种与培养1.准备厌氧细菌培养物的接种种子。
一般情况下，把生长适应在厌氧条件下的细菌进行分生处理来获得设计数量的细胞，并将其重新悬浮在与培养基相同的缓冲液中。
2.在无氧条件下接种厌氧菌，避免暴露于空气中。
可以通过使用瓶盖和橡胶塞的局部替代或全封闭气密容器的方法来实现无氧条件。
细菌标本片的制备及染色方法PPT精选文档
1
实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
2
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
10
（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
11
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
12
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
14
3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。
火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。
此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
微生物实验四细菌的涂片及简单染色法和革兰氏染色法经典法
【实验报告】
• 2）填表
•
表1 细菌形态的描述
【实验报告】
•
2．思考题
•
（1）涂片为什么要固定，固定时应注
意什么问题？
•
（2）你在涂片染色过程中遇到了什么
问题？试分析其中原因？
•
ห้องสมุดไป่ตู้
（3）革兰氏染色中哪一步是关键，为
什么？你如何控制这一步。
•
（4）不经复染这一步，能否区别革兰
氏阳性菌和阴性菌？
• 2、仪器 显微镜(25台)； • 3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个）
，接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油 ，吸水纸，染色缸等；
【实验用品】
• 4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet , CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。
1）草酸铵结晶紫染液的配制：
A液： 结晶紫
•
染色前必须先固定细菌，其目的有二
：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘
附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力
。常用的有加热和化学固定两种方法。固
定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞
膨胀或收缩。
【基本原理】
• 二、革兰氏染色法（经典法）基本原理 • 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重
要性状 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观
【方法步骤】
• 3、染色
•
⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结
晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。
倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
•
⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
•
⑶脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立
细菌标本片的制备及染色方法
目录
• 引言 • 细菌标本片的制备 • 染色方法 • 染色步骤 • 结果观察与解读 • 注意事项与局限性 • 展望与未来研究方向
01 引言
目的和背景
01
细菌标本片的制备及染色是微生 物学实验中的基础操作，旨在通 过观察细菌的形态、染色特性等 ，对细菌进行鉴别和分类。
02
02 细菌标本片的制备
涂片制备
选择适当的涂片材料
常用的涂片材料包括载玻片、盖玻片 和胶片，根据不同的需求选择合适的 涂片材料。
制备涂片
涂片厚度控制
涂片的厚度会影响染色效果和显微镜 观察效果，因此需要控制涂片的厚度， 使其符合实验要求。
将细菌样本均匀涂布在涂片材料上， 确保涂层薄而均匀，无气泡或杂质。
方法进行染色的方法。
步骤
特殊染色法的步骤因不同的染色对 象而异，一般包括涂片、固定、染 色和复染等步骤。
结果
通过特殊染色法可以显示细菌的特 殊结构和成分，有助于细菌的分类 和鉴别。
04 染色步骤
初染
使用结晶紫进行初染，将结晶紫染液滴加在细菌标本片上， 确保覆盖整个菌落。
静置片刻，让结晶紫充分染色，然后用清水冲洗，去除多余 的染料。
06 注意事项与局限性
实验操作注意事项
确保实验室环境清洁
在制备细菌标本片时，应确保 实验室环境的清洁，避免污染
。
严格无菌操作
在操作过程中，应遵循无菌原 则，使用无菌器材和试剂，以 避免交叉污染。
选择适当的染色方法
根据实验目的和要求，选择适 当的染色方法，以确保结果的 准确性和可靠性。
控制染色时间
染色时间对染色效果有很大影 响，应严格控制染色时间，避
免染色过度或不足。
实验二 细菌抹片的制备及染色
实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。
上课，点名入座。
板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。
2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。
3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。
1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。
2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。
三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。
2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。
如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。
B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。
（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。
A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
提高实验效率
在这次实验中，我们发现了一些 可以改进的地方，希望在未来的 实验中能够通过改进提高实验效
率。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
有助于判断细菌的分类。
细胞质结构
观察细菌细胞质的颜色、颗粒 大小、分布等特征，有助于判 断细菌的种类和生长状态。
鞭毛等特殊结构
观察细菌是否有鞭毛、菌毛等 特殊结构，有助于判断细菌的
致病ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和分类。
细菌分类的初步判断
革兰氏染色法
通过革兰氏染色法可以将细菌分 为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 两大类，有助于初步判断细菌的
实验细节注意不够
在染色过程中，我发现自己对一些细节问题没有给予足够的重视， 导致染色效果不佳，未来应更加注重细节。
对未来实验的展望
探索更多染色方法
我希望在未来的实验中，能够探 索更多不同的染色方法，以了解
各种方法的优缺点。
深入研究细菌种类
通过这次实验，我对细菌有了更 直观的认识，希望在未来的实验 中能够深入研究更多种类的细菌。
01
02
03
涂片制备
在洁净的载玻片上滴一滴 无菌水，用接种环取少量 细菌样品与水混合，然后 涂抹均匀，制成涂片。
干燥
将涂片放在实验台上自然 晾干，大约需要10-15分 钟。
固定
将干燥后的涂片放入火焰 中加热，使细菌固定在载 玻片上，防止在染色过程 中脱落。
染色镜检
染色
脱色
选择适当的染色液（如结晶紫、番红等） ，将涂片浸入染色液中，染色时间根据染 色液和细菌种类而定。
常用染色方法
革兰氏染色、抗酸染色、荧光染色等。
染色镜检的观察方法
显微镜观察
实验四 细菌抹片的制备及染色
涂片方法
（一）菌落涂片方法 涂片时，滴一滴蒸馏水至载玻 片上，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金 耳）在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少 许菌落，置于蒸馏水中混匀，涂成直径1-1.5cm 的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成。
（二）菌液涂片法 用灭菌接种环沾取菌液（液体培 养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环， 均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1-1.5cm左右圆 形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。
实验四 细菌抹片的制备及染色
一 目的要求
1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰染色法； 2.认识革兰染色的反应特性。
二 革兰染色的原理
革兰染色的原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构 的不同。
革兰阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖 网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小， 通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞 内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。
（二）革兰氏染色法
1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、 固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出 的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
三 实验报告
说明革兰氏染色的方法，原理，染色特点。
请预习下周实验内容： 细菌的生化实验
ห้องสมุดไป่ตู้
涂片方法
（三）血液涂片方法 先取一张干净无油垢边缘整齐 的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在 另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一 端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。
细菌标本片的制备及染色
细菌标本片的制备及染色目的要求能利用不同的材料进行细菌标本片的制备，会进行常规染色，并认识细菌的不同染色特性。
仪器及材料酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等。
方法与步骤 4大步：涂片→干燥→固定→染色（一）病料触片、美兰染色1．触片(抹片)用剪刀和镊子将剪刀和镊子在火焰上灼烧灭菌，稍冷却后，用镊子固定病料一角，剪刀剪下，将切面在玻片上涂抹或压印。
剪刀和镊子用完后一定要灭菌；整个操作过程始终在酒精灯附近进行。
2．干燥触片涂面向上，置火焰上方约20cm处加热干燥。
3．固定固定的方法因染色方法不同而异。
美兰染色和革兰氏染色用火焰固定。
(1)火焰固定是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上方约10cm处来回通过数次，以手背触及玻片微烫手为宜。
(2)化学固定血片、组织触片用瑞氏或姬姆萨氏染色时，用甲醇固定。
固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上，水洗时不易冲掉。
兼有灭菌作用。
4．染色在经火焰固定的抹片上，滴加美蓝染色液覆盖整个涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干，镜检。
结果：病料和细菌都呈蓝色。
（二）细菌培养物涂片、革兰氏染色1．涂片取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，无菌操作从固体细菌培养物上挑取菌落或菌苔少许，与生理盐水混匀，作成直径1cm的涂面。
接种环使用前后都需灼烧灭菌。
整个操作过程始终在酒精灯附近进行。
若为组织病料，则用烙刀和接种环进行涂片。
方法为：用烙刀在病料表面某处进行烧烙→烙刀灭菌后在烧烙处切口→接种环灭菌后从切口处伸入取病料→将病料涂于玻片上做成涂面。
2．干燥触片涂面向上，置火焰上方约20cm处加热干燥。
【宠物微生物课件】细菌标本片的制备与染色
滴加革兰氏碘溶 液，作用时间13min；水洗。
滴加95%乙醇溶 液，脱色30s1min，水洗。
四、实验方法
滴加石炭酸复红 复染10-30s；水
洗。
将染好的涂片用 吸水纸吸干。
油镜观察，判断 菌体的革兰氏染
色反应性。
四、实验方法
革兰氏阳性杆菌
革兰氏阴性杆菌
感谢各位聆听
细菌标本片制备与染色
宠物微生物学
细菌标本片制备与染色
细菌标本片 制备与染色
一 、实验目的 二 、实验原理 三 、实验器材 四、实验方法
一、实验目的
01
掌握细菌标本片的制备方法。
02
细菌的革兰氏染色法。
03
细菌标本片的显微镜观察。
细菌标本片 制备与染色
一 、实验目的 二 、实验原理 三 、实验器材 四、实验方法
二、实验原理
02
试剂：结晶紫、碘液、 95%酒精、石炭酸复红、 蒸馏水、香柏油等。
细菌标本片 制备与染色
一 、实验目的 二 、实验原理 三 、实验器材 四、实验方法
四、实验方法
四、实验方法
01
涂片
03
固定
05
媒染：碘液 1min，水 洗
07
复染：复红 30-60s， 水洗
09
镜检：油 镜
02
晾干
04
结晶紫染 色：1min， 水洗 Nhomakorabea06
脱色：95% 乙醇2025s，水洗
08
晾干
四、实验方法
取干净载玻片一块， 在载玻片中央滴加 一滴蒸馏水，按无 菌操作法取大肠杆 菌涂片，做成菌液。
让涂片自然晾干 或者在酒精灯火 焰上方文火烘干。
免疫学实验课件：实验二细菌抹片制备及染色、培养基的制作、
固定： 做好的涂片染色前必须先固定。目的是杀死细菌，
同时增加细菌对染料的亲和力。固定方法有两种：
1、火焰固定：将干燥好的抹片，使其抹面向上，以 其背面 在酒精灯外焰上略做加热。
2、化学固定：将以干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟， 自然挥发干燥。
做好的抹片就可以进行各种染色方法了。
2.染色方法
几种常用的染色方法：美蓝染色法，瑞士染色法染色法， 抗酸染色法，革兰氏染色法。重点介绍革兰氏染色法。
五 、方法和步骤
培养基的配方
1.普通肉汤培养基，琼脂培养基的制备 100ml肉汤 牛肉膏粉 0.5克 蛋白胨 1克 氯化钠 0.5克
普通琼脂：1.取50ml肉汤分装试管10支／4-5ml 2.取50ml肉汤+1.5~1.8克（琼脂粉2-3%） 用电磁炉加热熔化琼脂（需要完全融化） 10支／4-5ml
革兰氏染色法的原理：
革兰氏阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经95%酒 精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫 色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。
❖ 革兰氏阴性菌的细胞壁。其脂类含量较多，当以95%酒
精脱色时，脂类被溶去，使得细胞壁空隙变大，尽管95% 酒精处理能使肽聚糖空隙缩小，但因其肽聚糖含量较少， 细胞壁缩小有限，故让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物 被95%酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染 成红色。
制备方法与步骤：
• 1.准确称量 • 2.混合加热溶解调pH值至7.6 • 3.加热煮沸维持5分钟（注意补充体积） • 4.过滤 • 5.分装：4-5mL/管 • 5.灭菌15p 15-20min (103.41kpa 15磅压力） • 6.营养琼脂趁热摆斜面，完全凝固后，放置
37℃培养箱进行无菌检查，18-24小时后放4 ℃冰箱备用。
细菌标本片的制备及染色[总结]
![细菌标本片的制备及染色[总结]](https://img.taocdn.com/s3/m/393eb560f56527d3240c844769eae009581ba2b9.png)
一、细菌标本片的制备1.抹片（1）固体培养物：取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，取1-2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。
接种环用后需要灭菌。
（2）液体培养物：可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环，在玻片上作直径1cm涂面。
（3）液体病料（血液，渗出液，腹水）：取一张边缘整齐的载玻片，用一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，一45°角均匀推成一薄层的涂面。
（4）组织病料：以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。
无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察2.干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂片涂面向上，置于火焰高处微加热干燥。
3.固定（1）火焰固定。
是常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（4-6次），以手背触及玻片微烫手为宜。
（2）化学固定。
有的血片，组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定3-5min二、常用的细菌染色法1.美蓝染色法：在经火焰固定的涂片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2-3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干镜检，结果，菌体呈蓝色2.革兰氏染色法。
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染1-3min，水洗（2）加革兰氏碘液媒染，作用1-2min，水洗（3）加95%酒精脱色约30s至1min，水洗（4）加稀释石碳酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检3.瑞士染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞士染色液于涂片上以固定标本，1-3min后，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水与玻片上，轻轻摇晃使染色液混合均匀，5min左右水洗，干后镜检，菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色4.姬姆萨染色法。
血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定3-5min，干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的缸里，染色30min，或者染色数小时或24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。
实验二细菌抹片的制备及染色
实验二细菌抹片的制备及染色目的要求1．掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。
2．认识革兰氏染色的反应特性。
操作步骤染色是细菌学上一个重要而基本的技术。
由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别。
因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察。
也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。
一、载玻片处理载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理。
（一）滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次。
（二）若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。
玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈，用以标记。
二、涂片方法（一）菌落涂片方法涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1～2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成。
（二）菌液涂片法用灭菌接种环沾取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。
（三）血液涂片方法先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。
（四）组织涂片方法先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。
三、干燥涂片最好在室温中自然干燥。
必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。
四、固定有两种固定方法（一）火焰固定将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰四次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度。
细菌的抹片制做及染色
实验三细菌的抹片制做及染色【目的要求】(1)了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理(2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤【器材】(1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18．24小时液体培养物和斜面培养物。
(2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。
(3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。
【原理】细菌个体微小，无色而半透明，折光性弱，在普通光学显微镜下观察活细胞时，只能见其大致轮廓。
必须制成抹片标本，应用适当染料染色后，才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造。
此外，还可根据细菌呈现出的不同颜色反应而对其进行鉴别。
【内容和方法】(一)细菌抹片标本的制备1.抹片根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异(1)固体培养物用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环，蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央，再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中，涂抹成直径为1—1．5cm大小的均匀菲薄的抹片。
(2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1．2环，涂抹于玻片上即可。
但应注意净管底Iili物摇匀，以免影响涂片效果。
(3)组织涂片用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。
如为肝脾组织，脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。
无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察。
2.干燥将抹片置于空气中让其自然干燥3固定固定的方法因材料不同而异：(1)火焰固定细菌培养物抹片，常采用火焰固定法，即将已干燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(用手背触及抹片反面，以不烫手为宜)。
(2)化学固定血液、组织等抹片常用此法固定，即以数滴甲醇滴加在玻片上，固定3．5min。
抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉，并能改变细菌对染料的通透性，增加与染料的亲和力而更容易着色，同时多数细菌能被杀死。
(二)细菌的常用染色方法1.简单染色法只用一种染料进行染色的方法。
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三、实验材料
①菌种 牙垢细菌；大肠杆菌24 h培养液； 枯草杆菌12 h 培养液
②载玻片、接种环、镊子、酒精灯、染色液、火柴 ③显微镜、吸水纸、酒精乙醚溶剂
四、实验步骤
(一) 细菌染色方法
1．单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别 微生物及它的特殊构造 2．复染色法：用两种或两种以上染色液进行，常用： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染 色法、细胞染色法等
染色剂，按其电离后所带电荷的性质分：
1、酸性染料 酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑 2、碱性染料 碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、 甲基紫等，细菌易被碱性染料染色
3、中性染料： 伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等 （常用于细胞核染色） 4、单纯染色： 这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物， 不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类的染料。
革兰氏染色视频
思考题
1. 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些 操作？
注意事项
革兰氏染色成败与否与许多因素有关 菌龄 涂片厚薄 脱色时间（最为关键）
示范照片
简单染色视频
四、实验步骤
(三) 革兰氏染色法
革兰氏染色是Gram发明的一种细菌鉴别染色法， 通过染色，可将细菌分为两大类：一类被染成紫色，称
为革兰氏阳性细菌，另一类被染成红色，称为革兰氏阴
性细菌。这种染色的结果主要与细菌的细胞壁结构和化 学组成有关。
步骤
①涂片 ②初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液， 染1 min，倾去染液，流水冲洗至无紫色 媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆 盖涂面1 min，后水洗 ③脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约 30 sec，后立即用流水冲洗 ④复染：滴加番红染色液，染1 min，水洗后用吸 水纸吸干 ⑤镜检：观察染色结果并绘图
染色技术：涂片—— 干燥 ——固定—— 染色—— 媒 染 —、实验步骤
(二) 牙垢细菌单染色法
①菌种：牙垢细菌 ②涂片 ③干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热 ④固定 ⑤染色：在整个涂面上滴加石碳酸复红，染色1 min ⑥水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下水中无 染料颜色为止 ⑦干燥：空气中自然干燥 ⑧镜检：在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图
实验二 细菌的涂片及染色
本次实验内容
1.目的要求 2.染色剂及染色原理 3.实验材料
4.实验步骤
5.思考题
一、目的要求
①学习细菌涂片的基本技术
②掌握细菌的简单染色和革兰氏染色法
二、微生物染色的基本原理
借助物理和化学因素的作用而进行 1、物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细 现象、渗透、吸附作用等。 2、化学因素如：正负离子之间的相互吸引等