广西杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

弗 兰克 氏菌 （ ｒｎｉ） 一 类 能 与 非 豆 科 植 物 Ｆａｋ 是 ａ 共生结瘤进 行 固氮作 用 的放线 菌。杨梅 （ ， Ｍｙ ￣ａ ｒｂａ 是 我 国南 方 的 特 产 水 果 ， 是 一 种 能 与 弗 兰 ｕｒ） 也 克 氏 菌 共 生 结 瘤 固 氮 的 果 树 。 在 自然 状 态 下 ，
而
南
农
业
学
掇
２１ ０ ２年 ２ ５卷 １ 期
Ｖｏ． ５ １２ Ｎ仉 １
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文章编号 ：０ １ ４ ２ （ ０２ ０ ０ ３ ０ １０ — ８９ ２ １ ） １— ２ ６— ４
的９ 株分离物均为 Ｆａ ｋ ｒｎｉ ａ的成员 ， 革兰 氏阳性菌。 选择其中的 Ｍ ３ Ｍ Ｆ 、 Ｆ 株分离菌株进一步研 Ｆ 、 ６ Ｍ ９３ 究菌体形态和培养特性。
于 Ｑ“ 平 板培 养 基 和 斜 面 培 养 基 中 ， 于 ２ 下 置 ７ 黑 暗静 止 培养 。培养 ２ ０ｄ后 ， 观察培 养特 征 。
培养 基 培养 ２ ， Ｑ” 固体 培养 基 上 划 线培 养 获 ０ｄ在
１２ １ 分 离方 法 采 用 根 瘤切 片法 和 Ｑ” 改 良培 ．． 养基¨ 分离 Ｆａｋａ菌 株 。 ｒｎｉ
１２ ２ 分 离茵株 固体培养特征 ．．
将分离菌株接种
得单菌落， 经镜检和革兰 氏染色初步确认分离获得
１２ ３ 分 离株液体培养特征 将在 Ｑ ．． “液体培养基 上同步培养的不 同分离株离心收集沉淀 ， 用无菌水洗涤 ２ ２ 分 离菌株 培养特 征观 察 ． 并将沉淀悬浮均匀制成菌悬液， 分别取等量菌悬液接种 ２２ １分 离菌株 固体培 养特 征 在 Ｑ” 平板 培养 基 ．． 于 Ｂ ｐｌ无氮液体培养基 中。接种后 ， Ａ Ｃｌ ｏ 置于 ２ ７℃下黑 上 Ｆ ａ ｋ ３ Ｍ Ｆ 、 ９菌 株培 养 前 期形 成 圆形 ｒｎ ｉ ＭＦ 、 ６ ＭＦ ａ 暗静 止 培养。培养 ２ 后， ０ ｄ 观察菌体生长状况。 较小 的菌落， 桔红色、 淡黄色、 淡粉色等 ， 以后菌落逐 １２４ 茵体 形 态观 察 采 用 贴 片 法将 分离 菌 株 接 渐长大 ， ． ． 至培养后期 （０～ ０ｄ 菌落颜色和形状发 ３ ５ ） 种于 Ｑ 培养基平板 ， “ 同时接种于 Ｂ Ｐ Ａ 无氮液体培 养基 ， 分别于培养 ７一 ０ ２ 、０ｄ的时间段取样 ， ｌ 、０３ 光
离 出 Ｆａｋａ菌并 成 功进 行离 体 培 养 ， Ｆａｋ ｒｎｉ 对 ｒｎｉ ａ的
研究 取得 了较 大 进 展 。 目前 为 止 ， 内外 已有 不 少 国
从 杨梅 中分 离到 内生 菌纯 培 养 物 ， 进 行 相 关 的生 并 物 学特性 研 究 的报 道 。 日本 的 Ｈｙｓｉ ｉｏｈ 等 ｊ 中 国 和 科 学 院沈 阳应 用 生 态 研 究 所 的 丁 鉴 和 张 忠 泽 从 杨 梅根 瘤 中曾分 离 出 Ｆａｋ ｒｎｉ 株 ； 新 华 等 研 ａ菌 何
Ｆ Ｎ ｉ －ｎ ， Ｅ Ｘｎｈ ａＬ ｉ ｅ，ＩＦ ｎ ， Ｉ ｏｇｙｏ Ｅ Ｇ Ｊ ｎｌ ｇ Ｈ ｉ—ｕ ，ＩＹ— ｉＬ ｅ ｇＱ Ｎ Ｒ ｎ －ａ ａ ｉ ｗ （ ｏ ｅｅｏ ｇｉｕｔｒ， ｕｎｘ ｎｖｒｉ ， ｕｎｘ ａｎｎ ３０ ５，ｈｎ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｒ ｌ ｅ Ｇ ａｇｉ ｉ ｓｙ Ｇ ａｇｉ ｎ ｉｇ５ ００ Ｃ ｉ ｌ Ａ ｃ ｕ Ｕ ｅ ｔ Ｎ ａ
Ａ ｓ ａｔＴ ｒｅｅｄｐ ｙｅ，ｉ ｌｔ ｏ ｒｏ ｏｕｅ ｆ ｅ ａｂｒ Ｍｙｉ ｂａ ｙｎ ｄｌ ｃ ｏｉｇｉ ｕ ｎｘ， ｅｅｉｅ ｔ ｅ ８ ｂ ｔ ｃ：ｈｅ ｎ ｏｈｔｓ ｓ ａ ｄｆ ｍ ｔ ｄ ｌ ｏ ｄｂｙｅｒ ｒ ｏ ｅ ｒ ｏ ｎ ｓ ｒ ｙ（ ｒａｒ ｒ）ｂ ｏｕｅｓ ｔ ｎｎ Ｇ ａｇｉ ｗ ｒ ｄｎ ｆ ａ ｃ ｕ ｅｉ ｎ ｉｄ ｉ
８、 ０ 葡萄糖 ４种碳源分别加到无碳源 的 Ｂ Ｐ培养 Ａ
基中（ ． ０ １％ Ｎ １ 氮 源 ） 终 浓 度 为 ０ １％ ， ＨＣ 为 ， ． 以
无碳源的 Ｂ Ｐ培养基作 为对 照。将不 同分离株 菌 Ａ
２ ２２ 分 离茵株液体 培养特征 分离菌株经 Ｑ“ ．． 液体培养基培养 ， 菌体沉人底部 ， 团絮状生长， 或粘 后期生长菌体表现出与固体培养菌落相 悬液等量接种到上述不同碳源的培养基 中， 同一分 附于瓶壁 ， 离株 相 同处 理重 复 ３次 。置 于 ２ ７℃ 的 培养 室 中暗 同的颜 色 。分 离 菌 株 能在 Ｂ Ｐ无 氮 培养 基 中 生 长 Ａ 培养 ２ ， Ｂａｆｒ ０ ｄ 用 ｒｄｏｄ改 良法 Ｈ ¨测 定 菌 体 蛋 白含 良好 ， Ｂ Ｐ无 氮液 体培 养 时 ， 在 Ａ 出现 白玉色 、 粉 色 淡 絮状 生长 ， 动分 散形 成小 颗粒 状 ， 止不 悬 浮而 沉 摇 静 量， 用菌体蛋 白含量代表菌体生长状况。
２ 结 果 与 分析
２ １ 杨梅根 瘤 Ｆ ａ ｋ ． ｒｎｉ 株分 离结 果 ａ菌
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
供试根瘤采 自广西大学农学院果树种质资源圃 的广 西本 地杨 梅 。
１ ２ 方 法 ．
采用根瘤切片法和 Ｑ 培养基 进行杨梅根 瘤 ” 弗 兰 克 氏菌 的分 离 ， 离培 养约 经过 ｌ ， 分 Ｏｄ 原接 种黑 色 瘤瓣 组织边 缘陆 续开 始长 出淡 黄色或 桔 黄色 生长 物， 其后该生长物逐渐扩大 ， 形成表面隆起 、 光滑 ， 有 光 泽 的菌落 。长 时 间培 养 后 ， 的菌 株菌 落 会 变 黑 有 褐色， 有褶皱。培养 ３ 后将菌落转移至 Ｑ 液体 ５ｄ ”
生菌为 Ｆａ／ａ日． 分别命 名为 ＭＦ 、 ６和 Ｍ 。对这 ３株分离株在不同碳 源、 ｒｎ ｄ ｐ， ３ ＭＦ 氮源和 ｐ Ｈ值的培 养特性进 行研 究。结果表明 ， ３
株 分离株在分别 以吐温 一 Ｏ 葡萄糖、 ８、 丙酸钠为碳 源的 Ｂ Ｐ培养 基上 生长 良 ， 株分离株对琥珀酸钠 的利用较差 ； 宜的氮源 为 Ａ 好 ３ 适 酵母 膏、 酪蛋 白和氯化铵 ， 尿素 的利用率低。３株分 离株均适合在 ｐ ． ６ ５范围内生长 ，Ｈ７ ０以上 生长 受到抑制 。 Ｈ ５５－ ． ｐ ． 关键词 ： 杨梅 ；ｒｎｉ； Ｆ ａｋ 资源； ａ 分离； 培养 特性
学显 微镜 下 观察 菌体 形 态 。
１ ２ ５ 碳 源的 利 用 选 取 琥 珀 酸 钠 、 酸钠 、 温 ．． 丙 吐
一
生变化。其 中， Ｆ 菌株 由桔黄色圆形菌落逐渐变 Ｍ３ 为黑 褐色 ， 光 泽 ； Ｆ 有 Ｍ ６菌 株 由表 面 光 滑 的淡 黄 色 圆形菌落 ， 逐渐变为表面干燥 ， 有褶皱的黑色菌落 ； ＭＦ ９菌株 由初 期淡 黄 色 圆形 菌 落 ， 渐 变 为 表 面 突 逐 起、 有褶皱 的淡 黄色 菌落 。
收稿 日期 ：０ １—０ ２１ ７—１ ４ 基 金项 目： 国家 自然科学基金项 目（ ￣ ０ ００ ） Ｃ １ １６ ２ 作 者简介 ： 冯健玲 （９０一） 女 ， １６ ， 广西桂 平人 ， 副教授 ， 研究 方 向 为微生物 生态和生物防治。
用及 固氮 活性 ； 小 明 研 究 了 １株 福 建 杨 梅 共 生 范
中 图分 类 号 ：６ ７ ６ ￥６ ． 文 献标 识码 ： Ａ
Ｉｏ ａ ｉ ｎ ａ ｌｕ ａ ａ ｕ ｅ ｆＦｒ ｎ ｉ ｏ ｓ ｌ ｔｏ ｎｄ Ｃｕ ｔ ｒ ｌＦｅ ｔ ｒ ｓ ｏ ａ ｋａ ｎ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Ｒｏ ｔＮｏ ｕ ｅ ｏ ｄ Ｂａ ｂ ｒ ｙ ｉ ａ ｇ ｉ ｏ ｄ ｌ ｆＲｅ ｙ ｅ ｒ ｎ Ｇｕ ｎ ｘ
菌在不同条件下的回接侵染效果 ； 志真 …对福建 李 南部 、 中部和东北 部的杨梅根瘤共生菌进 行 了分离 和菌 株培养 、 步 鉴定 及 侵 染 特 性 检 测 。由 于 杨 梅 初
地理 分布 广泛 ， 被不 同类 群 的 Ｆａｋａ侵 染 ， 混 能 ｒｎｉ 是 杂性 宿 主ｒ 卜引， 从杨 梅根 瘤 中分离 获 得 的 Ｆａｋａ菌 ｒｎｉ
Ｆｒｎ ｉ ｐ ｄ ｂｂ ｄ ＭＦ ＭＦ ｎ ９． ａｅ ｌ ｔｅｒｓ ｔ ｒｍ ｃｏｃ ｐｃｅ ａ ｎ ｔ ｎ，Ｇｒｍ—ｔｉｉｇ，ａ ｄｃ ｌ ｒｌｃ ａａ ｔｒｓｉｓｏ ａ ｋａ ８ ． ｕ ｅ ３， ６ ａ ｄ ＭＦ ｂ ｓｄ Ｏｌ ｈ ｕ ｓｆ ｅ ｌ ｏ ｍｉｒｓｏ ｉ ｘ ｍｉａｉ ｏ ａ ｓａｎｎ ｎ ｕｔ ａ ｈ ｒｃｅｉｔ ｎ ｕ ｃ Ｎ－ｅ ｃｅ ｔＢＡＰ ｍｅ ｉｍ． ｆｅ ｔ ｆｃ ｒｏ ｏ ｒｅ ，ｎｔｏ ｅ ｏ ｒｅ ｎ Ｈ ｎｔｒｅＦｒｎ ｉ ｓｒｉｓｗｅｅｓｕ ｉ ｙ ｍｉｒ ｓｏ ｉ． ｅ ｒ— ｄ ｆ ｉｎ ｉ ｄ ｕ Ｅ ｃｓｏ ａｂ ｎ８ｕ ８ ｉｒｇｎ ８ｕｃ ｓａ ｄ ｐ ｏ ｈｅ ｅ ａ ｋａ ｔ ｎ ａ ｒ ｔｄｅ ｂ ｄ ｃｏｃ ｐｃ Ｔｈ ｅ ｓ ｉ ｈ ｗｅ ｔａ ｈｅ ｕｔ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔｔｒｅＦｒｒｄ ｓｒｉｓｇｅ ｖｒ ｓ ａｄ ａ ｔａｎ ｒｗ ｅｙｗｅｌｏ ＡＰ ｍｅ ｉｍ ｔＩｗｅ ｎ８ ｌ ｎＢ ｄ ｕ ｗｉ ｔ ｅ －０，ＳＵ Ｏ ，ｓｄｕ ｐｏ ｉｎ ｔ ｓｓｌ ａ ｂ ｎ ｓｕｖ ｅ ｌ ｌｅ ￣ ｏ ｉｍ ｒｐｏ ａｅａ ｏｅｃ ｒｏ ｅ ｌ， ｒ－ ． ｅ ｓ ｅ ｔ ｅｙ，ｂ ｔｔｅｔｒｅ ｓ ａｎ ｉｎ’ ｅｐ ｎ ｌ ｔ ｎｂ ｒａ ｉ． ａｔｅｔａ ｔ，ｃｓ ｍｌｏ ａ ｉ ｎ ｍｌｏ ｎ ｌ ｈｏｉｅｔｒ ｅ ｕ ｏｂ ｐ ｃｉ ｌ ｖ ｕ ｈ ｈ ｅ ｔ ｉ ｓｄｄ ｔｒｓ ｏ ｄ ｗｅｌ ｏ ａｌｅ ｃｄ Ｙｅ ｓ ｘｒｃ ｒ ｓ ａａ ｎ ｃｄ ａ ｄ ａ ｎ ｎ ｎ ｌｒｄ ｕ ｎ ｏ ｔｔ ｅ ｉ ｃ ｄ ａ ｐ ｏ ｒａｅ ｎｔ ｇ ｎＳ ｕｃ ． ｅｕｉｚｔｏ ａｅｏ ｌａｗａ ｌｗ． ｅｔｒｅｓｒｉｓｇ ｐ ｒｐｉｔ ｉ ｒ ｅ ｏ ｒｅ Ｔｈ ｔｉａｉｎ ｒｔ ｆｕ－ ｏ ｌ ｅ ｓ ｏ Ｔ ｈ Ｉ ｅ ｔａｎ ｗ ｗ ｌ ｕ ｄ ｒｔｅｒｎ ｅ ｏ ｐ ｌ ｅｌ ｎ ｅ ｈ ａ ｇ ｆ Ｈ５． ５—６ ５，ｂ ｔｔｅ ． ｕ ｈ ｙｗｅｅ ｒ ｉｈｂｔｄｗｉｈｔ ｅｐ ｖ ｌｅｏ ｅ ０． ｎ ｉｉｅ ｔ ｈ Ｈ ａｕ ｖｒ７． Ｋｅ ｒ ｓ： ｒ ａｒ ｂａ； ａ ｋａ； ｓｕｃ ｓ ｙ ｗｏ ｄ Ｍｙ ｉ ｕ ｒ Ｆｒｎ ／ Ｒｅｏ ｒｅ ；Ｏｓｈｆ ｎ； ｌ ｒｌｃ ａａ ｔｒｓｉｓ ｃ ｅ ｉ ｏ Ｃｕｔ ａ ｈ ｒｃｅ ｔ ｕ ｉ ｃ
分离株存 在着丰富的遗传 多样 性 。开展 广西杨 Ｊ
梅根 瘤 Ｆａｋ 的 分 离 培 养 和 研 究 ， 利 于 丰 富 ｒｎｉ ａ 有
１ 期
冯健玲 等 ： 广西杨梅根瘤 Ｆａｋａ菌 的分离和培养特性研究 ｒｎ／
２７ ３
Ｆａ ｋ ｒｎｉ ａ菌种 资源 ， 于 了 解 不 同地 域 、 护 和利 用 对 保 Ｆａｋａ资源 具有 重要 意义 。 ｒｎｉ
广 西 杨 梅 根 瘤 Ｆａｋ ｒｎ ｉ 的 分 离 和 培 养 特 性 研 究 ａ菌
冯健玲 ， 新华 ， 何 李一伟 ， 李 峰 ， 荣耀 秦
（ 广西 大学农学 院， 广西 南宁 ５ ００ ） ３０ ５
摘
要： 采用 根瘤 切片法从广西本地杨梅根瘤 中分 离获得 ３株 内生茵 ， 经镜检、 革兰氏染色和 Ｂ Ｐ无氮培养基培养 ， Ａ 证实这 ３株 内
究 了 ３株 浙 江杨 梅 Ｆ ａ ｋ ｒｎ ｉ 形 态 培 养 、 氮 源 利 ａ的 碳
Ｆａｋ 在杨梅根部形成根瘤 ， ｒｎｉ ａ 通过共生体系固定大 气中的氮素 ， 改善根系周围的土壤肥力 ， 使其在养分 贫瘠的土壤 中生长 良好 ¨ 。因此 ， Ｊ 杨梅是一种治理 水土流失 、 改善生态环境且经济效益显著 的优 良经 济林果树种 ， 开展杨梅根 瘤 Ｆａ ｋ ｒｎｉ ａ的研究具 有重 要的经济价值和生态价值。 自从 １７ ９ ８年 Ｃｌ ｈｍｌ 等 从 香 蕨 木 根 瘤 中分 ａａａ ２ ｌ