高密度发酵

3. 培养基

3.1 一级种子：胰蛋白胨10 g/Ｌ

LB培养基酵母提取物5 g/Ｌ

氯化纳10 g/Ｌ

PH 7.3 加水至1L

3.2 二级种子：胰蛋白胨16 g/Ｌ

２×ＹＴ培养基酵母提取物10g/Ｌ

氯化纳 5 g/L

PH 7.3 加水至1L

LK：LB＋卡纳霉素（50mg/L）

3.3 罐料培养基：胰蛋白胨102g

酵母提取物64g

葡萄糖 6.4g

氯化钠 1.6g

磷酸氢二钠48g

磷酸二氢钾9.6g

氯化铵 3.2g

氯化钙0.035g

硫酸镁 3.2g

维生素B1 0.1g

PH 7.2 加水至3.2L

3.4 补料培养基：酵母提取物200g

胰蛋白胨20g

甘油200ml

葡萄糖10g

硫酸铵5g

硫酸镁5g

维生素B1 0.1g

原始PH，加水至0.8-1.0L

以上培养基中均加卡纳霉素，加量50mg/L

胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品，卡那霉素为Genview公司产品，IPTG为Japan 产品，其余试剂为国产分析纯。发酵罐：NBS5LBioflo3000，扫描仪(GE公司U9909-H7L0),Unico7200分光光度计。

4. 实验方法与过程

发酵工艺路线：保藏菌种单菌落一级种子（F1）二级种子(F2) 发酵离心收集菌体。

4.1 菌种活化与扩大培养

将保藏在-20℃工作种子液解冻,取10μl，梯度稀释，10-5、10-6、10-7涂LB平板37℃培养16-18小时左右生产单菌落。

F１发酵菌种：挑取LK平板单一菌落，接入50ml/250ml三角瓶LB培养基中（含卡纳霉素）37℃，200rpm培养箱8～10小时，至O.D600×10达0.25～0.35。F２发酵菌种：将F１按0.5%接种量接到200ml/1000ml三角瓶，2×YT培养基中（含卡纳霉素）37℃,200rpm摇荡培养，培养7～8小时至O.D600×10达0.3～0.5。

4.2 发酵罐发酵培养

将生长好的F2，400ml种子液接入发酵罐，37℃培养至O.D600×100达40-50，加IPTG诱导，加量0.1～0.2mmol/L，诱导3.5～4小时，压缩空气做气源，保持通气量1vvm ，溶氧控制30－45%，发酵2.5小时左右开始通氧，发酵过程控制pH7.0－7.2，每隔１小时取样一次，测O.D600至最大，不再增长。补料速率在培养阶段控制在补料泵10%－40%，随发酵时间以10%增长，诱导阶段，补料速率控制在补料泵20%－40%，在诱导阶段第一小时内补料速度最大,放罐前半小时停止补料。

检测

4.3.1测O.D600 ：使用“7200”分光光度计,波长600nm；

对照:蒸馏水；

样品:发酵液用蒸馏水稀释至合适倍数。