扩增片断长度多态性(AFLP)概述
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[编辑本段]AFLP反应流程
AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本骤。各步骤具体的过程有： 首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA片段的预扩增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。 Genomic AFLP cDNA-AFLP
AFLP（amplified fragment length polymorphism）技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。 AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
[编辑本段]AFLP技术的应用
AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景。如： 构建遗传连锁图谱 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记 AFLP辅助的轮回选择育种 利用AFLP技术研究基因表达与调控 分类和进化研究 甲基化研究
[编辑本段]AFLP 技术主要特点
（1）分析所需 DNA 量少，仅需 0.5μg。也可以用作于线粒体 DNA。从线粒体中得到RFLP 研究所需的几十到上百μg 的 DNA 是很困难的。Roseudahl 和 Taylor(1997) 成功地从一种真菌(Mycorrhizal fungi) 的单个孢子中得到 AFLP 标记，而每个单孢子仅产生约0.1～0.5μgDNA。另外,AFLP 反应对模板浓度的变化不敏感，DNA 浓度在 1000 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大,所产生的指纹图谱十分相似。 （2）可重复性好。AFLP分析基于电泳条带的有或无,高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA酶切不完全而产生的失真,PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度,因而AFLP分析具有很强的可重复性。Jones等（1997）在欧洲8个实验室使用共同的样本，进行严格的实验，将得到的DNA图谱进行比较，172条谱带中仅一条出错，误差小于0.6% 。 （3）多态性强。AFLP 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目,来调节扩增的条带数,具有较强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应地产生不同的 AFLP 引物，引物 3'端的选择性碱基数目可以是 2+2, 2+3 也可以是 3+3，这些碱基的组成也是多种多样的。由于 AFLP 引物设计的巧妙与搭配的灵活，使得 AFLP 能产生的标记数目是无限的。迄今为止，每个 AFLP 反应能检出多态片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一种分子标记所无法比拟的。 （4）分辨率高。AFLP 扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电泳分离，因此片段多态性检出率高，而 RFLP 片段相对较大，内部多态性往往被掩盖。 （5）不需要 Southern 杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组 DNA的序列信息，是一种半随机的 PCR。 （6）样品适用性广。AFLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA ,如基因组山东农业大学博士学位论文29DNA、cDNA、质粒、某一个基因或基因片段,且不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物,可对各种生物的DNA 进行分子遗传标记研究。 （7）稳定的遗传性 AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel式遗传规律，种群中的 AFLP 标记位点遵循 Hardy－Weinberg 平衡总之，在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害和 RAPD稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时又兼有二者之长。近几年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记。
AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本骤。各步骤具体的过程有： 首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA片段的预扩增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。 Genomic AFLP cDNA-AFLP
AFLP（amplified fragment length polymorphism）技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。 AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
[编辑本段]AFLP技术的应用
AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景。如： 构建遗传连锁图谱 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记 AFLP辅助的轮回选择育种 利用AFLP技术研究基因表达与调控 分类和进化研究 甲基化研究
[编辑本段]AFLP 技术主要特点
（1）分析所需 DNA 量少，仅需 0.5μg。也可以用作于线粒体 DNA。从线粒体中得到RFLP 研究所需的几十到上百μg 的 DNA 是很困难的。Roseudahl 和 Taylor(1997) 成功地从一种真菌(Mycorrhizal fungi) 的单个孢子中得到 AFLP 标记，而每个单孢子仅产生约0.1～0.5μgDNA。另外,AFLP 反应对模板浓度的变化不敏感，DNA 浓度在 1000 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大,所产生的指纹图谱十分相似。 （2）可重复性好。AFLP分析基于电泳条带的有或无,高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA酶切不完全而产生的失真,PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度,因而AFLP分析具有很强的可重复性。Jones等（1997）在欧洲8个实验室使用共同的样本，进行严格的实验，将得到的DNA图谱进行比较，172条谱带中仅一条出错，误差小于0.6% 。 （3）多态性强。AFLP 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目,来调节扩增的条带数,具有较强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应地产生不同的 AFLP 引物，引物 3'端的选择性碱基数目可以是 2+2, 2+3 也可以是 3+3，这些碱基的组成也是多种多样的。由于 AFLP 引物设计的巧妙与搭配的灵活，使得 AFLP 能产生的标记数目是无限的。迄今为止，每个 AFLP 反应能检出多态片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一种分子标记所无法比拟的。 （4）分辨率高。AFLP 扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电泳分离，因此片段多态性检出率高，而 RFLP 片段相对较大，内部多态性往往被掩盖。 （5）不需要 Southern 杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组 DNA的序列信息，是一种半随机的 PCR。 （6）样品适用性广。AFLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA ,如基因组山东农业大学博士学位论文29DNA、cDNA、质粒、某一个基因或基因片段,且不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物,可对各种生物的DNA 进行分子遗传标记研究。 （7）稳定的遗传性 AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel式遗传规律，种群中的 AFLP 标记位点遵循 Hardy－Weinberg 平衡总之，在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害和 RAPD稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时又兼有二者之长。近几年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记。