食品卫生微生物检验

《食品微生物检验》部分复习题
一、名词解释
1、无菌:对一个环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在；用于取样时，是指取样过程中避免因操作引起人为的污染。

2、致病菌:能引起疾病的微生物。

3、菌落总数:食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度、培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。

4大肠菌群:需氧及兼性厌氧，能在37℃ 48h 分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。

5粪大肠菌群:需氧及兼性厌氧，能在44.5℃±0.5℃，24h发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌又可称耐热大肠菌群。

6大肠杆菌:需氧及兼性厌氧，能在44.5℃±0.5℃，48h分解乳糖产酸产气，生化特征“IMViC”
为“+ +﹣﹣或﹣ +﹣﹣”的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌又可称大肠埃希氏菌。

7最可能数（MPN）:基于泊松分布的一种间接计数方法，是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。

适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。

8血清学试验:在食品微生物检验中，用血清学反应（即用相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象）来鉴定分离到的细菌，以最终确定检测结果的试验。

9 n；c；m；M
n：系指一批产品采样个数。

c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。

m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。

M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。

10鉴别培养基:通过化学试剂显示出培养基上混合生长的微生物中有某种微生物。

11选择性培养基:通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。

二、问答题
1．食品微生物检验或食品卫生微生物检验检验什么微生物？
食品微生物检验主要是检验与卫生有关的微生物，也就是关注病原体，这些微生物能引起疾病。

2．食品的微生物指标主要包括哪些？《食品微生物学》书P552
细菌总数、大肠菌群、致病菌、霉菌和酵母
3．革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的区别及相关特性。

版本1：（老师上课时讲的，书上P1）
革兰氏阴性菌细胞壁薄，多层；对物理因素抵抗力差，对化学因素抵抗力强;不产生芽孢；主要源于粪便；
革兰氏阳性菌细胞壁厚，结构单一；对物理因素抵抗力强，对化学因素抵抗力差；产生芽孢；明显与环境、土壤和沉积物相关
版本2：（网上找的）
两者主要是细胞壁的结构不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁，是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成。

肽聚糖的肽链之间通过5个甘氨酸交联着。

革兰氏阴性菌的细胞壁则是多层结构，从内到外依次是：薄薄的肽聚糖层，脂蛋白层/周质层，磷脂层和脂多糖层。

革兰氏阴性菌的肽聚糖结构也和革兰氏阳性菌的有所不同，肽链是直接交联在一起的。

细胞壁结构的不同，决定了两类细菌革兰氏染色结果(阳性紫色阴性红色)和对不同类抗生素敏感性的不同。

版本3：（网上找的）
1.细胞壁组成成分不同。

革兰氏阳性菌（G+）细胞壁含大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖；革兰氏阴性菌（G-）含极少肽聚糖，独含脂多糖，不含磷壁酸。

两者的不同还表现在各种成分的含量不同，尤其是脂肪含量很明显，G+脂肪含量为1%-4%，G-脂肪含量为11%-22%.
2.细胞壁结构不同。

G+细胞壁较厚，厚度为20—80nm，结构较简单；G-细胞壁较薄，厚度为10nm，其结构较复杂，分为外壁层和内壁层，外壁层又分3层，最外层是脂多糖，中间是磷脂曾，内层为脂蛋白，内壁层含肽聚糖，不含磷壁酸。

4．列举一些常检验的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阴性菌：沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌
革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、腊样芽孢杆菌
5．沙门氏菌食物中毒为什么经常发生？
1.）沙门菌属广泛分布于自然界，在人及动物，如家畜中猪、牛、羊、猫、狗，家禽中鸡、鸭、鹅等均有广泛的宿主；
2）.沙门氏菌的宿主特异性极弱，既可以感染动物也可以感染人类，极易引起人类的食物中毒，沙门氏菌食物中毒以胃肠型最为常见；
3.）沙门氏菌在外界的生活力较强，由于沙门氏菌属不分解蛋白质，不产生靛基质，污染食物后无感官性状的变化，易被忽视而引起食物中毒。

6. 简述食用贝类可能传播病毒性疾病的原因。

①进入贝类水域有壳水生物的病原性病毒能够在那里积聚并能存在数月，在冬天和较低温下能够存活很好，而恰恰是在那时大量捕获贝类供食用；
②从未许可的水域内进行不合法的捕获贝类，将加重因贝类引起病毒性疾病的问题；
③已污染的贝类通过滤过食物将其消化系统中的病毒和细菌清除掉，但一般来说，清除病毒的时间比清除病菌要长，所以清除完细菌不一定表明已清除完病毒。

7．说明非即食类预包装食品的采样方法。

样品常规采集量为多少？
非即食类预包装食品的采样方法：
原包装小于500g的固态食品或小于500ml的液态食品，取相同批次的最小零售包装；大于500ml的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一无菌采样容器内，采样总量应满足微生物指标检验的要求。

样品常规采集量为：（？？？不确定）
1）无论采用何种方法取样，每批货物的取样数量不少于5件；对于需要检验沙门氏菌的食品，取样量应适当增加，最低不少于8件；
2）实验室检验样品一般为25g
8.培养基一般的杀菌温度和时间为多少，不同培养基杀菌条件是否完全一样，为什么？请举例说明。

培养基一般的杀菌温度和时间为121℃,15min
不同培养基杀菌条件不一样，因为不同培养基的营养成分不同，为防止其营养成分破坏起不到营养作用，从而导致细菌不能生成。

举例：有些培养基中的成分高温容易变性，温度就会降低一点，常用的是115℃，如三糖铁琼脂培养基。

11. 革兰氏染色原理是什么?简述革兰氏染色的过程，并说明革兰氏染色的成功与否取决于哪些因素？为什么？
革兰氏染色原理
主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同，因而对结晶紫-碘复合物的渗透性不同，导致了不同染色反应。

G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

革兰氏染色法一般包括涂片→固定→染色（初染、媒染、脱色、复染）→镜检
具体操作方法是
1）涂片
2）固定
3）染色
①初染：用结晶紫，染色1min，水洗
②媒染：加碘液覆盖1min后，水洗
③脱色：连续滴加95%的乙醇，约30s，直到滴下的乙醇无色为止，水洗
④复染：加番红染色1min，水洗
4）干燥
5）镜检：先低倍镜，后油镜观察。

革兰氏染色的成功与否取决于的因素：
培养菌的菌龄
一般用新的培养的细菌较好。

培养时间过长，有些细菌会死亡，并出现菌体变形，自溶等现象，影响染色结果。

涂片的厚度
若涂片太厚，会造成染片中菌体堆积，影响观察结果。

若涂片太薄，菌体太稀少，怕观察时难以找到视野。

干燥的温度
细菌涂片一般让它自然干燥，有时为了使它干的快些，可以把涂片很小心地在酒精灯火焰上微微摆动使它干燥，温度以不超过手背的耐受力为限。

若温度过高，细菌会发生菌体变形，影响观察结果。

固定的操作
固定的目的是为了杀死细菌，使涂抹于载片上菌体很好地附着于玻片上，防止被水冲掉，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力更强。

因此固定时，将涂片慢慢从火焰上通过2~3次，使菌体受热固着于玻片上。

当固定温度太低，固定不够时，菌体附着于玻片上不够牢固，水洗时很容易被水冲掉；如果固定温度太高，固定时间过久时，菌体很易变形，影响镜下观察结果。

酒精脱色时间
脱色时间一般为30s左右，如果脱色时间过度，很多革兰氏阳性菌亦可被脱色而误认为阴性菌；如果脱色时间不足，则革兰氏阴性菌也因脱色时间不够而会被认为是阳性菌。

载玻片的清洁度
载玻片应清洁，无油污。

若有油污，则细菌在玻片不能均匀的散开，影响涂片效果。

12. ICMSF采样的基本原则是什么？二级抽样方案和三级抽样方案是根据什么确定？
基本原则：
（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。

（2）食品经不同的条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同的采样数。

二级抽样方案和三级抽样方案是根据食品中微生物的危害度确定
在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害度低的建议使用三级抽样方案。

13. 请说明冷冻生虾大肠菌群标准n=5，c=3，m=40，M=400的意义，所采用的是何种抽样方案及其理由。

其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许≤3个检样的菌数是在40~400之间，如果有3个以上检样的菌数是在40～400之间或一个检样菌数超过400者，则判定该批产品为不合格品。

所采用的三级抽样方案，二级法只设有n、c、及m值，三级法则有n、c、m及M值。

14.什么是菌落总数？菌落总数的测定有什么意义？
菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度、培养时间等）培养后，所得每g （ml）检样中形成的微生物菌落总数。

意义：第一，它可以作为食品被污染程度的标志。

一般来讲，食品中细菌总数越多，则表明该食品污染程度越重，腐败变质速度加快。

第二，它可以用来预测食品存放的期限程度。

15. 如何选择样品的适宜稀释度？
①根据样品污染程度
②根据食品标准
16. 不同食品菌落总数测定采用的培养温度和时间是否相同，各适用于什么食品，为什么？
不同，一般食品 36℃±1℃培养48h±2h ，
水产品 30℃±1℃，培养72h±3h
我国对水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃培养温度；
17. 菌落总数平板计数方法行标跟国标的不同主要在哪？应如何计算？报告的菌落总数方式如何？请举例说明。

计算：行标P124，国标P32-33
18、说明出口食品微生物检验工作台的要求和微生物的要求。

工作台：超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。

微生物：无菌操作（？？？不确定）
19．什么是大肠菌群？大肠菌群数的测定有什么意义？
意义：第一、它可作为粪便污染食品的指标菌。

大肠菌群数的高低，表明了食品被粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小。

第二、它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌。

20．大肠菌群数是如何计数的？其表达单位及表达方式如何？请举例说明。

（1）MPN计数，
按确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表
报告每g（ml）样品中大肠菌群的MPN值
举例：采用3个稀释度0.1g，0.01g，0.001g，每个稀释度接种3管，经最后证实每个稀释度都有2个阳性管，查表，则每克该样品的大肠菌群数为35MPN/g
（2）平板计数
①选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落；
②经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落，再乘以稀释倍数，即为每g（ml）样品中大肠菌群数。

举例：书P38
10-4（10的负4）样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑选其中10个接种BGLB 肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100*（6/10）*10-4/g（mL）=6.0*（10的5次方）CFU/g（CFU/mL）。

23．检验大肠杆菌的生化反应主要是哪四种，根据什么反应结果判断是典型大肠杆菌？
生化反应：靛基质试验、MR试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验
根据以下结果判断是否为典型大肠杆菌
靛基质试验阳性，即上层出现红色；
MR试验阳性，即培养物变红；
VP试验阴性不变色，仍为黄色
Korse氏肉汤：生长情况：浑浊
28．沙门氏菌的检验为什么要采用前增菌和选择性增菌？试从所用的时间、温度和培养基的不同来说明。

前增菌原因：凡经冷冻、干燥、酸碱及辐照处理的食品，需进行预增菌，利于受损伤菌的恢复，通常用缓冲蛋白胨水（BPW）。

TTB、SC选择性增菌原因：使沙门菌以外的细菌（主要E.Coli）受到抑制，而使沙门氏菌属得到一定的增殖。

选择性增菌要采用TTB与SC的原因：
沙门氏菌有2000多个菌型，一种增菌液不可能适合所有的沙门氏菌生长，因此沙门氏菌增菌要同时用两种培养基增菌。

SC更适合伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌增菌，最适增菌温度为36度，TTB更适合其他沙门氏菌增菌，最适增菌温度为42度。

为提高检出率，防止漏检，所以选择两种培养基与两
个温度。

TTB主要成分及作用：
蛋白胨、牛肉膏：提供碳、氮源、维生素，满足生长需要。

氯化钠：维持均衡的渗透压。

碳酸钙：中和细菌产生的酸及吸收有毒代谢产物。

碘与硫代硫酸钠：可生成四硫磺酸钠，能抑制大肠杆菌的生长。

胆盐：抑制大肠群菌和其它G+菌，促进沙门氏菌的生长。

煌绿：又叫亮绿，为金黄色闪光结晶，可溶于水与乙醇。

对大肠菌有很强的抑制作用。

亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液主要成分及作用
蛋白胨：提供碳、氮源。

乳糖：可发酵糖类，沙门氏菌属大部分不发酵乳糖，但在含有乳糖的鉴别培养基上经36℃培养8-24h 后，其菌落一般为无色透明或半透明、中等大或较小、边缘整齐、光滑、稍呈隆起。

但要注意沙门氏菌Ⅲ是发酵乳糖的，有的可迅速发酵，在鉴别培养基上形成发酵乳糖的菌落。

磷酸氢二钠：缓冲剂。

亚硒酸氢钠：抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰氏阴性肠道菌。

L-胱氨酸；促进生长。

革兰氏染色原理是什么?简述革兰氏染色的过程，并说明革兰氏染色的成功与否取决于哪些因素？为什么？
答：（1）原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

（2）革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。

先再玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环取菌少许与水滴混合均匀，涂成一薄层，直径大约1厘米，用酒精灯干躁。

2）初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗。

3）媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗。

4）脱色：连续滴加95%乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。

5）复染：加番红染色1分钟，水洗
革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。

假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果
3）影响革兰氏染色的因素：
1菌龄
用于革兰氏染色的细菌应是正处于对数生长期的细菌, 一般在适宜培养条件下, 细菌十几小时即进入对数生长期。

若培养时间过长, 细菌进入稳定期或衰亡期, 对革兰氏阳性菌来说,随着衰退型或死亡菌体的大量出现及菌体的自溶, 其细胞壁失去了保留结晶紫的能力, 就会表现出阴性反应。

相对而言, 革兰氏阴性菌其革兰氏染色反应稍稳定一些, 但菌龄过长, 菌体会出现异常形态, 着色力会大为减弱故用于实验的G+菌(如枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)菌龄以不超过小时为宜, 一般为16一18小时, G-菌(如大肠杆菌)菌龄以18一24小时为宜.
2涂片质量
涂片时取菌要少, 涂片层应薄, 要保证菌体分散均匀, 避免涂片过厚, 因G-菌大量聚集起来则呈假阳性反应,取菌时用接种环轻触固体斜面菌苔, 然后在载玻片的生理盐水中充分涂布,使生理盐水稍显混浊
即可.若发现载玻片上的菌液过于混浊, 则说明取菌太多,应加少量生理盐水稀释,并用吸水纸从边缘吸掉过多的菌液。

3脱色程度
这是革兰氏染色中最关键的一步，脱色不够, 会将G-菌误染为G+菌；脱色过度则将G+菌误染为G-菌,操作时应在载玻片下衬一白纸条作背景, 将乙醇脱色流液的颜色变化和脱色时间二者紧密结合起来判断脱色程度, 当脱色二十多秒时应密切观察乙醇流液颜色, 发现刚刚不出现紫色时即停止, 马上用水冲掉乙醇。

4染色及脱色均匀度
染色及脱色是否均匀也直接影响染色结果在初染、媒染及复染时, 应将染液覆盖整个菌膜, 避免一部分菌染色而另一部分菌没染色脱色时也应用乙醇流经整个菌膜, 否则会造成一部分菌脱色而另一部分菌可能没有脱色而导致实验失败。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的区别及相关特性。

答：1）.细胞壁组成成分不同。

革兰氏阳性菌（G+）细胞壁含大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖；革兰氏阴性菌（G-）含极少肽聚糖，独含脂多糖，不含磷壁酸。

两者的不同还表现在各种成分的含量不同，尤其是脂肪含量很明显，G+脂肪含量为1%-4%，G-脂肪含量为11%-22%.
2.）细胞壁结构不同。

G+细胞壁较厚，厚度为20—80nm，结构较简单；G-细胞壁较薄，厚度为10nm，其结构较复杂，分为外壁层和内壁层，外壁层又分3层，最外层是脂多糖，中间是磷脂曾，内层为脂蛋白，内壁层含肽聚糖，不含磷壁酸。

4．列举一些常检验的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

答：常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等。