蛋白质的提取与检测

蛋白质的提取与检测

第一节细胞总蛋白的提取及含量测定

【基本原理】

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；

③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA（Bicinchoninic acid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuret reaction）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

【试剂配制】

1. 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174g PMSF溶解于100ml异丙醇，分装于

1.5ml离心管中，-20℃保存。

2.细胞裂解液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1mM PMSF，1mM

EDTA，1% Triton X-100，4℃保存。

3.100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.1g，0.15mol/L NaCl 1ml，充分溶解

后-20℃保存。

4.0.15mol/L NaCl：0.877g NaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。

5.考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 100mg，95%乙醇50ml，磷酸

100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。

6.PBS缓冲液（pH

7.4）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g，KH2PO4

0.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至

1L，常温保存备用。

【操作步骤】

一、细胞总蛋白的提取

1.人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10% FBS

的DMEM培养基，37℃、5% CO2条件下常规培养。

2.去除培养液后以预冷的PBS冲洗2～3遍。

3.加入适量的预冷的裂解液后置于冰上20～30 min，不时摇动。

4.用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，转移将细胞碎片和裂解液至预冷的

1.5ml离心管中；。

5.4℃、12 000 rpm离心15min。

6.将上清分装至1.5ml的EP管中，-20℃冻存备用。

二、蛋白含量测定（BCA法）（碧云天P0012）

1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

2. 完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20uL。

4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液（PBS）到20uL。每个样品三个重复。

5. 各孔加入200uLBCA工作液，37℃放置30分钟。也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。

6.酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

标准品OD值标准品浓度ug/uL

0.078 0 0.099 0.025 0.118 0.05 0.154 0.1 0.213 0.2 0.283 0.3 0.329 0.4 0.404 0.5

第二节SDS-PAGE电泳

【基本原理】

SDS-PAGE电泳技术（SDS polyacrylamede gel electrophoresis）首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。

SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键（氢键和疏水键）。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。当蛋白质的分子量在15～200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质的分子量。

【试剂配制】

1.10%SDS：10g SDS加入100ml去离子水中，50℃水浴下溶解，室温保存。

2. 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Tris-base 45.43g，加入200ml去离子水溶解后，

用浓盐酸调pH至8.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

3. 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Tris-base 30.29g，加入200ml去离子溶解后，用

浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。4.电泳缓冲液：Tris-base 3.03g，Glycine 18.77g，SDS 1g，加入适量去离子水

溶解后定容至1L，室温保存。