乳鼠心肌细胞培养(自己总结)

15-20 只动物用 200ml 消化液。
另记住加双抗
如想加胶原酶，则 100ml 需胶原酶 II 110mg
3．注意事项: a. 1 次最多养 20 只【每 T25 需 1.2 只乳鼠（1-3 天）】 b. 酒精需浸泡乳鼠两次消毒 c. 消化时间不能超过 16 次，8 次以内最佳
＞1 个滤器 3 个玻璃平皿 吸管
试剂 PBS 溶液
含 10%FBS 的 乳鼠心肌细胞
DMEM
消化液
数个塑料平皿
恒温磁力搅拌 器
二．实验步骤： 1. 超净台紫外线照射 30 分钟，3 个平皿中加适量的 PBS，4 个 50ml 离心管中各
加 10ml 含 10%FBS 的 DMEM；用 75％酒精消毒乳鼠后，左手捏住其颈部， 伸长其躯干，剪刀从剑突左缘剪开胸骨，暴露心脏后用镊子夹出置于 PBS 中 清洗。 注意：酒精中不要混有杂物，拿取酒精泡过后的乳鼠时，尽量不要碰其心胸 部，以防污染。 2. 将清洗后的心脏置入另一个平皿中小心尽可能多的除去结缔组织，收集心脏 用剪刀剪碎：左手弯镊在心房口处夹住，右手直镊摘取多余结缔组织。 3. 加 10ml 消化液后用吸管移至刻度瓶中，37 度水浴调节到适当的转速。头二个 8 分钟消化后，弃去上清，第三个 8 分钟收集的消化后的上清转移至含 10ml10%FBS 的 DMEM 的 50ml 离心管中。此后每 8 分钟收集一次。每次加 10ml 消化液。当消化后的上清变成近似于无色澄清后可以终止消化。 4. 收集的消化液离心 1200rpm，12 分钟，25 度（室温）。弃去上清，加适量含 10％FBS 的 DMEM，260 目滤器过滤后进行差速贴壁。(每 T75 瓶 12ml,3 瓶
附： 1. 用于心肌细胞培养的 Brdu 溶液的配制： 取 0.031gBrdu 粉剂溶于 10ml 无血清的 DMEM 中，以 0.22μm 滤器过滤除菌。 1ml/管分装于 EP 管中，-20°C 保存，使用时以 1ml 对应于 100ml 培养基。
2. 心肌细胞消化液的配制（0.08%Trypsin）：
ຫໍສະໝຸດ Baidu
试剂
200ml
250ml
Trypsin
0.16
0.2
NaCl
1.6g
2
NaHCO3 葡萄糖
0.0706g 0.1982g
0.088 0.24775
KCl
0.0596g
0.0745
HEPES
0.4
0.5
ddH20
200ml
250ml
完成后，用 0.22μm 滤器过滤除菌（现用现配）
用加转子的瓶搅拌 1hr 后用 0.22μm 滤器过滤除菌。5-10 只 动物用 100ml 消化液，
乳鼠心肌细胞培养步骤
吴益和 1982wuyihe@sohu.com 北京协和医学院，阜外心血管病医院，心外科&心血管病学国家重点实验室
一． 器械及试剂准备
器械
＞6 个 50ml 离 1 个 15ml 离心
心管
管
＞2 把眼科剪 ＞2 把弯头镊 子
75％酒精
烧杯
＞1 个 260 目 虑网 1 个刻度瓶， 内装小转子 手套
*12ml=36ml) 5. 贴壁时间 1 小时，将 DMEM 转移到 50ml 离心管里，1000 转/分，10 分钟，
25 度离心，弃上清加含 brdu 的培养液。（每个 T25 培养瓶 4ml） 6. 头 48 小时培养基中加终浓度为 0.0031%的 BRDU，此后可以换成正常培养基。
一般 72 小时后细胞密度可以达到 80-90%