大肠杆菌表达条件优化

基因表达载体的构建--大肠杆菌高效表达重组蛋白策略*

SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA的3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。

将全部SD序列按作用强弱不同分为三类：强、中、弱，发现强弱不同时最偏好模式不同，如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式，AAGGA是强SD序列的最偏好模式。同一模式距起始密码子的距离不同时，所起的调控作用也不同，如GGAG模式中的A在强SD序列中位于-8位点，在弱SD序列中位于-7和-9位点。平均来说，各SD序列的-9位点上碱基G出现的概率最大。结果还表明SD序列越强，基因的表达水平越高，SD序列越弱，基因表达水平越低。SD序列与anti-SD序列的配对程度和相对位置影响起始密码子的识别和翻译效率。

信号肽结构对蛋白分泌的影响

周质空间（Periplasmicspace）又称周质或壁膜空间。在革兰氏阴性菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12-15nm），呈胶状。肽聚糖薄层夹在其中。可认为它是原核生物的一个特殊“细胞器”。在周质空间中，含有多种周质蛋白，包括：1、水解酶类，如蛋白酶、核酸酶等；2、合成类，如肽聚糖合成酶；3、结合蛋白（具有借促进扩散而运送营养物质的作用）；4、受体蛋白（与蛋白的趋化性有关）。

信号肽：引导蛋白分泌到胞外，最后被信号肽酶切除。

前导肽：

分子伴侣：将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素（nucleoplasmin ）称为分子伴侣。根据Ellis 的定义，这一概念延伸为“一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装（帮助新生肽的折叠、帮助新生肽成熟为活性蛋白、帮助蛋白质跨膜定位、亚基组装等），而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能的组份”。换言之，细胞质中一类蛋白，能够识别并结合到不完整折叠或装配的蛋白质，帮助这些多肽正确折叠、转运或防止他们聚集，其本身不参与最终产物的形成。热休克蛋白就是一大类分子伴侣。

首先，在蛋白合成过程中，伴侣分子能识别与稳定多肽链的部分折叠的构象，从而参与新生肽链的折叠与装配。例如，植物光合作用的关键酶——二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶（Rubisco）在合成时，新合成的亚基单体组装成全酶（共8 个大亚基、8个小亚基，大亚基基因组叶绿体编码，小亚基基因组核编码）之前，就有Rubisco结合蛋白（RBP）参与，实际上就是一种“分子伴侣”。大亚基先与RBP结合，然后与转运进叶绿体的小亚基装配成完整的全酶。抗RBP的抗体阻止新合成的亚基装配成Rubisco。类似的还有大肠杆菌中的“分子伴侣”GroEL，它与GroEs基因构成Gro操纵子，成为热休克蛋白基因调节因子的重要组

成部分，参与侵入噬菌体衣壳的组装。线粒体基质中的HSP60（单体分子量60KD，但实际上是十四聚体）参与了H+-ATP酶F1的β-亚基跨越线粒体膜后与其它亚基间的组装以及鸟氨酸转氨甲酰酶的折叠与组装。内质网膜上的“分子伴侣”免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip）能促进跨膜输入的蛋白质的组装。随着基因工程研究的发展，人们还发现将外源基因导入大肠杆菌进行表达时，其产物虽具有预定一级结构，但并未形成具生物活性的空间结构，这提醒人们有必要了解外源基因在原来生物体内表达时是否有分子伴侣的参与？是哪一类分子伴侣的参与？这些问题的澄清无疑将提高基因工程的效益。

参与蛋白运送

在蛋白跨膜运送过程中，也有分子伴侣的参与。核糖体上新合成的多肽在定向跨膜运送到不同细胞器时，要维持非折叠状态。分子伴侣Hsp70家族在蛋白移位中就能打开前体蛋白的折叠，这时跨膜蛋白疏水基团外露，分子伴侣能够识别并与之结合，保护疏水面，防止相互作用而凝聚，直至跨膜运送开始。跨膜运送后，分子伴侣又参与重折叠与组装过程。

修复热变性蛋白

另外，特别值得一提的是，有一类分子伴侣属于热休克蛋白(HSP）。这种蛋白是1962年Ritossa在研究果蝇唾腺染色体时首先发现的。果蝇一般在25℃正常生长，当外界温度升至30～40℃时，果蝇体内产生较多的HSP。后来又在酵母、玉米、大豆、大肠杆菌等中发现。当外界温度高出正常生长温度10～15℃，HSP大量诱生。近年来的研究表明在正常生长条件下，这类HSP仍少量存在。以前认为HSP功能是机体为应付不良环境产生对热变性蛋白的修复，进一步研究才知正常生理条件下，HSP对蛋白跨膜运输，结构折叠也有重要作用。上面提及的HSP70、HSP60、GroEL都属于HSP。

作用

免疫保护

分子伴侣不仅是胞内蛋白折叠、组装与转运的帮助蛋白，更令人惊奇的是它还可以成为感染性疾病中的免疫优势抗原（immunodominant antigens），激发宿主体内的体液免疫反应和T细胞介导的细胞免疫反应，证实在细菌或寄生虫感染中具有免疫保护作用（Minowanda 1995,Young 1992）。这说明分子伴侣有可能用作疫苗，来抵抗微生物的感染，并用来治疗肿瘤和自身免疫疾病（Suto 1995）。用一个96Ku的肿瘤相关分子伴侣免疫肿瘤病人，已进入一期临床实验（Edgington 1995）。动物疾病模型中的胰岛素依赖型糖尿病、风湿病等可被分子伴侣cpn60抑制，可能是cpn60-反应性T淋巴细胞起了作用。某些情况下，分子伴侣如cpn10中的妊娠早期因子（early pregnancy factors,EPF）具有免疫抑制作用，因而具有安胎、防止习惯性流产等治疗价值（Cavanagh 1994）。生理情况下，诱导热休克蛋白Hsp70等的过度表达，能使机体具有更高的缺血耐受能力，减少急性成人呼吸窘迫症造成的器官损害（Currie 1993）。眼球晶状体中的（-晶体蛋白（（-crystallin）可以防止其他晶体蛋白的聚集和浊化，因而能够防治白内障（Graw 1997）。随着年龄的增长和受紫外线照射累加效应的影响，可导致（-晶体蛋白的分子伴侣活性减弱，这常常是老年性白内障的病因之一。而有些药物如阿斯匹林、indomethacin等也能介导产生热休克反应。

致病作用