弯曲杆菌的分离鉴定

弯曲杆菌的分离鉴定
主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中弯曲杆菌的检验方法。

本标准适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。

其他出口食品可参照使用。

2 设备和材料
2.1 微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。

可用具双相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置。

2.2 天平：称量2000g,感量0.1g。

2.3 均质器。

2.4 离心机：带50mL离心管。

2.5 显微镜：相差或暗视野。

2.6 培养箱：25,37和42℃。

2.7 水浴箱：37℃。

2.8 注射器：20mL。

2.9 针头过滤器：滤膜孔隙为0.65μm。

2.10 三角烧瓶：50,250和500mL。

2.11 平皿：90或100mm。

2.12 吸管：1和5mL。

2.13 试管：16mm×125mm,带螺旋帽。

3 培养基和试剂
3.1 弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途,加入1号或2号抗生素溶液制成(A1)。

3.2 弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基) (A2)。

3.3 含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤(A3)。

3.4 布氏琼脂(A4)。

3.5 营养肉汤(A5)。

3.6 中性红溶液(A6)。

3.7 3%过氧化氢溶液。

3.8 氧化酶试验试剂(A7)。

3.9 亚硝酸盐检测(硝酸盐还原) 试剂(A8)。

3.10 乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中,然后取出,使其干燥。

3.11 硝酸钾。

3.12 甘氨酸。

3.13 氯化钠。

3.14 盐酸半胱氨酸(cysteine-HCl)。

3.15 马尿酸钠(sodium hippurate)。

3.16 萘啶酮酸(nalidixic acid): 每个圆纸片含30μg。

3.17 头孢菌新素(又称先锋霉素Ⅰ,cephalothin): 每个圆纸片含30μg。

3.18 茚三酮(ninhydrin)。

3.19 丙酮。

3.20 丁醇。

4 增菌
4.1 碎牛肉
使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。

称取25g样品,置于均质杯内,加入100mL增菌肉汤,用均质器以8000～10000r/min均质30s。

将均质液通过灭菌纱布,倒入一个容量为250mL的三角烧瓶,置微需氧条件下,42℃培养24～48h。

4.2 净膛全禽和分割禽肉
在一个灭菌容器中,用250mL 灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。

取肉汤,经灭菌纱布过滤,于
23000×g、4℃离心20min,或于16300×g、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。

培养方法同4.1条。

4.3 牛奶
使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。

称取约40g牛奶放入离心管中,按4.2条中的方法离心。

弃去脂肪和上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL,增菌肉汤中,培养方法同4.1条。

4.4 贝类
使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。

将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中,
用均质器以8000～10000r/min转速均质30s。

用灭菌纱布将均质液过滤。

取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中,培养方法同4.1条。

4.5 其他食品
所使用的增菌方法决定于食品的种类。

虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法 (4.2条)处理后,用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。

羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理,再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。

碎肉按4.1条所列方法处理。

液体食品按4.3条所列方法处理。

各种样品的培养方法均同4.1条。

5 分离和初步鉴定
取5mL经24～48 h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤。

取经过滤和未经过滤的增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于两个平板。

将平皿置微需氧条件下42℃培养24～48h。

检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。

挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)显微镜检查,本菌呈现快速的螺旋样运动。

涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,如小逗点状,两菌体的末端相接时,呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。

挑取初步鉴定为弯典杆菌菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。

培养方法同上。

根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。

6 证实
6.1 生化试验
从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。

从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中,置微需氧条件下42℃培养24～28 h。

同时接种一份已知阳性培养物,以在整个证实试验中作为对照。

在大多数情况下,用于生长试验和生化反应的基础培养基是含0.18%琼脂的布氏肉汤。

这种培养基分装在16mm×125mm试管中,每管7mL。

从所有布氏肉汤中取出各接种物,滴加0.2～0.3mL于琼脂表面。

6.1.1 生长温度试验
接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置37℃培养,检查在这一温度下的生长情况,
并用于观察过氧化氢酶反应。

另两管分别置42℃和25℃培养。

每日检查有无生长。

对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

弯曲杆菌的生长应只限于接近培养基表面的一薄层,广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。

6.1.2 过氧化氢酶试验
滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内,出现气泡者为阳性反应。

6.1.3 氧化酶试验
使用琼脂平板表面经24h培养的生长物(也可取用于抗生素试验的平板),将氧化酶试剂滴于棉拭子上,并用棉拭子去接触表面生长物。

在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。

6.1.4 硝酸盐还原试验
将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基。

置空气中于37℃培养5d。

加入亚硝酸盐检测试剂甲液和乙液(A8),出现红色者表明硝酸盐还原成亚硝酸盐,为阳性反应。

6.1.5 1%甘氨酸中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。

置空气中于37℃培养。

每日检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。

6.1.6 3.5%氯化钠中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。

置空气中于37℃培养。

每日检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。

6.1.7 硫化氢产生试验
将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。

置空气中于37℃培养。

每日检查,观察滤纸条是否变黑,纸条变黑表明有硫化氢产生,为阳性反应。

对未出现阳性反应者需培养5 d,方可作出最后判断。

6.1.8 马尿酸盐水解试验
马尿酸盐水解培养基即1%灭菌马尿酸钠溶液,可用试管分装,每管0.4mL,冻存备用。

用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物,接种1%马尿酸钠溶液中,振摇试管以分散培养物,置37℃水浴中放置2h。

在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂 [将3.5g茚三酮溶于100mL 1:1丙酮和丁醇的混合物中],将试管于室温下放置2 h。

出现紫色者为阳性反应。

6.2 抗生素敏感性试验
用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。

将含头孢菌新素(30μg)和萘啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。

置微需氧条件下于37℃培养24h,检查有无抑菌圈。

6.3 根据下表对细菌作出鉴定
弯曲杆菌的特性鉴别
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┃ 弯曲杆菌
试验项目┣━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━
┃胎儿弯曲杆菌胎儿亚种┃空肠弯曲杆菌┃结肠弯曲杆菌┃NARTC**1)
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过氧化氢酶┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃ ＋
氧化酶┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃＋
硝酸盐还原┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃＋
半胱氨酸形成H2S ┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃＋
1%甘氨酸中生长┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃＋
3.5%氯化钠中生长┃ －┃ －┃ －┃－
37℃生长┃ ＋┃ ＋┃ ＋┃＋
25℃生长┃ ＋┃ －┃ －┃－
42℃生长┃ －┃ ＋┃ ＋┃＋
马尿酸盐水解┃ －┃ ＋┃ －┃－
萘啶酮酸试验┃ R**2) ┃S**2) ┃ S ┃ R
头孢菌新素试验┃ S ┃ R ┃ R ┃ R
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注：1) NARTC为抗萘啶酮酸嗜温弯曲杆菌。

2) R为耐受; S为敏感。