重组蛋白的分离纯化PPT课件

.
5
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞/组织 植物细胞/组织
.
6
酵母细胞
可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有 加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因 表达;
糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清 多糖浓度高;
商品化表达体系：
酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕赤酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidation, unwanted proteolysis and sample contamination with genomic DNA.
单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物
.
13
重组蛋白的分离纯化策略
重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择
.
14
针对不同的产物表达形式采取 不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓 度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法 先进行浓缩处理；
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和 Seperose。理想的分离纯化介质应具有下 列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉
.
18
Protein purification
Preparation of the bacterial lysate It is a critical step. Optimal conditions maximize cell lysis and
选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋 白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选 亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之 间的解离常数应在合适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离 的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体 的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大 的优越性。
重组蛋白的分离纯化
.
1
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
.
2
大肠杆菌 (Escherichia coli)
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品 化表达载体种类齐全，表达效率高；
基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的 立体结构)，无加糖等修饰
.
3
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
.
16
多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合 使用多种技术，一般来说，在选择分离纯 化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
.
17
合适分离纯化介质的选择
.
7
昆虫细胞
可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可 在体外培养细胞中生产蛋白;
适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；
糖链有所区别，表达量有限；
作为药物宿主细胞未被FDA认可
.
8
CHO细胞
可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖 方式与人体蛋白质完全一致；
表达量不够高，培养成本较高
.
9
动物乳腺组织
The lysis buffer should contain a strong buffer to overcome the contribution of the bacterial lysate, high ionic strength to enhance protein solubility, protease inhibitors and a reducing agent such as TECP to prevent oxidation of the protein.
分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质 至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适 合药用蛋白的生产；
转基因动物制作花费巨大，实验周期长
.
10
鸟类输卵管组织
分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清， 产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；
实验成本低，饲养费用低； 加糖方式可能与人有所不同
.
11
植物组织
.
19
About gHale Waihona Puke Baidul filtration
• The choice of gel filtration as the next step after IMAC may be surprising, considering its lower resolving power compared with ion exchange or other adsorption chromatography methods, but this step is often sufficient after IMAC if the protein was abundant in the lysate.
分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，
重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体
.
4
其他
乳酸菌
(Lactic acid bacteria)
沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
苏云金杆(Bacillus thuringiensis)
植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性
较难控制； 表达量较难提高，分离纯化不方便
.
12
体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收 包涵体；
采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶 性的，拟首先选用亲和层析进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质， 应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克 法释放重组蛋白。
.
15
针对不同性质的重组蛋白选择 不同的层析类型
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首