高效液相色谱的维护与保养
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超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低
缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度
溶剂：色谱纯，并与填料相匹配
溶剂中的杂质含量
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
正确使用色谱柱（二）
样品预处理
除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶
流动相的保存
有机溶剂流动相:
室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
保护柱
可避免化学污染 新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚
至可作为色谱柱使用 保护柱选择： 选用与色谱柱相同的填料
真正起到保护作用 保证色谱分离结果
色谱柱的保护
使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析
使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样
相同保护柱与色谱柱：第950次进样
2 星期 1 星期
1天 1 小时 新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期
高效液相色谱的维护与保养
液相色谱仪器的使用及保养
色谱泵的保养
流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用
水冲洗柱塞杆清洗孔 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为 准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性, 如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如: 使用无机盐缓冲液时 , 用前和用后均 须用水过渡
色谱测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽
测柱效的方法
色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可 按说明书所述方法测定 以下是Waters反相C18柱的测定方法:
流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙 腈,加入600μ l丙酮 进样量5μ l 检测波长:254nm
流 动 相洗 针 溶 剂 缓 冲 溶 液 ， 反 相 5 0 % 水 ∶ 5 0 % 甲 醇 纯 缓 冲 溶 液 1 0 0 % 水 异丙醇？ 非 水 溶 液 ， 反 相 1 0 0 % 甲 醇 正 相 流 动 相 流 动 相 G P C 离 子 交 换 对 离 子 试 剂 的 水 溶 液
液相色谱系统的清洗与钝化
解度，防止其在流动相中析出 尽量用流动相溶解样品
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作 用
流动相的脱气
流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确
输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 减少死体积 防止填料的氧化
提高检测的性能
保护色谱柱
流动相脱气的方法
加热
简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动 相组成的变化
更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样
色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解
用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
硅胶柱的一般方法
先用甲醇洗去极性杂质
记 住 ∶ 每 种 色 谱 柱 可 能 有 特 定 的 方 法 用干燥的二氯甲烷、正庚烷 100~200ml 依次活 化 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
键合相柱(烷基)的一般方法
20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗
色谱柱的存放
存放前的处理
除去杂质、缓冲盐
合适的存放溶剂
避免色谱柱床的干涸
避免机械震动
防止细菌生长
注意存放的温度
正确使用色谱柱（一）
流动相方面
除去微粒 纯度的要求
在线过滤器
In-Line
Filter，部件号 WAT084560
防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸 分析）
可更换的消耗品
更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)
温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的在线保护装置
给色谱柱提供物理的保护
除去样品及流动相中的颗粒
给色谱柱提供化学的保护
防止分析柱被化学污染
装置
在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱
一般采用30％磷酸作为清洗剂，用6M硝
酸作为钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的 污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成 光滑均匀的氧化膜
高效液相色谱的维护与保养
色谱柱的使用及保养
测柱效 – 良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录
1天
新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
检测器的保养
如长时间不用检测器可以关掉紫外灯
在4小时以上不用时，太频繁开关也不好
不要让缓冲液长期停滞在检测池内
用纯水冲洗
示差检测器及荧光检测器
注意流动池的耐压，不要在后面加压
Baidu Nhomakorabea
关于自动进样器的针清洗
Purge Injector 与 Needle Wash 洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus 的上部，应放于717plus同一水平面 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：
计算色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
V1 N s W
W
Wtan Wh W3s W4s W5s
2
s
16 5.54 9 16 25
方法
切线法 半峰高 3s 4s 5s
色谱柱的正确使用及操作
流动相的转换
特别是GPC柱
流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min
凝胶柱（GPC及糖柱）
抽真空
同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
超声波
简单，但效果不理想。
通惰性气体（一般用氦气）
可保持连续脱气，多用于低压梯度
在线脱气机
可保持连续脱气，多用于低压梯度
液相色谱对流动相的要求
除色谱柱对流动相的要求外，还有∶
与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 防止细菌的生长
缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度
溶剂：色谱纯，并与填料相匹配
溶剂中的杂质含量
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
正确使用色谱柱（二）
样品预处理
除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶
流动相的保存
有机溶剂流动相:
室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
保护柱
可避免化学污染 新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚
至可作为色谱柱使用 保护柱选择： 选用与色谱柱相同的填料
真正起到保护作用 保证色谱分离结果
色谱柱的保护
使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析
使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样
相同保护柱与色谱柱：第950次进样
2 星期 1 星期
1天 1 小时 新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期
高效液相色谱的维护与保养
液相色谱仪器的使用及保养
色谱泵的保养
流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用
水冲洗柱塞杆清洗孔 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为 准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性, 如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如: 使用无机盐缓冲液时 , 用前和用后均 须用水过渡
色谱测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽
测柱效的方法
色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可 按说明书所述方法测定 以下是Waters反相C18柱的测定方法:
流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙 腈,加入600μ l丙酮 进样量5μ l 检测波长:254nm
流 动 相洗 针 溶 剂 缓 冲 溶 液 ， 反 相 5 0 % 水 ∶ 5 0 % 甲 醇 纯 缓 冲 溶 液 1 0 0 % 水 异丙醇？ 非 水 溶 液 ， 反 相 1 0 0 % 甲 醇 正 相 流 动 相 流 动 相 G P C 离 子 交 换 对 离 子 试 剂 的 水 溶 液
液相色谱系统的清洗与钝化
解度，防止其在流动相中析出 尽量用流动相溶解样品
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作 用
流动相的脱气
流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确
输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 减少死体积 防止填料的氧化
提高检测的性能
保护色谱柱
流动相脱气的方法
加热
简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动 相组成的变化
更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样
色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解
用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
硅胶柱的一般方法
先用甲醇洗去极性杂质
记 住 ∶ 每 种 色 谱 柱 可 能 有 特 定 的 方 法 用干燥的二氯甲烷、正庚烷 100~200ml 依次活 化 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
键合相柱(烷基)的一般方法
20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗
色谱柱的存放
存放前的处理
除去杂质、缓冲盐
合适的存放溶剂
避免色谱柱床的干涸
避免机械震动
防止细菌生长
注意存放的温度
正确使用色谱柱（一）
流动相方面
除去微粒 纯度的要求
在线过滤器
In-Line
Filter，部件号 WAT084560
防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸 分析）
可更换的消耗品
更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)
温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的在线保护装置
给色谱柱提供物理的保护
除去样品及流动相中的颗粒
给色谱柱提供化学的保护
防止分析柱被化学污染
装置
在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱
一般采用30％磷酸作为清洗剂，用6M硝
酸作为钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的 污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成 光滑均匀的氧化膜
高效液相色谱的维护与保养
色谱柱的使用及保养
测柱效 – 良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录
1天
新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
检测器的保养
如长时间不用检测器可以关掉紫外灯
在4小时以上不用时，太频繁开关也不好
不要让缓冲液长期停滞在检测池内
用纯水冲洗
示差检测器及荧光检测器
注意流动池的耐压，不要在后面加压
Baidu Nhomakorabea
关于自动进样器的针清洗
Purge Injector 与 Needle Wash 洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus 的上部，应放于717plus同一水平面 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：
计算色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
V1 N s W
W
Wtan Wh W3s W4s W5s
2
s
16 5.54 9 16 25
方法
切线法 半峰高 3s 4s 5s
色谱柱的正确使用及操作
流动相的转换
特别是GPC柱
流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min
凝胶柱（GPC及糖柱）
抽真空
同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
超声波
简单，但效果不理想。
通惰性气体（一般用氦气）
可保持连续脱气，多用于低压梯度
在线脱气机
可保持连续脱气，多用于低压梯度
液相色谱对流动相的要求
除色谱柱对流动相的要求外，还有∶
与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 防止细菌的生长