乳酸菌

乳酸菌饮料中乳酸菌的检验

1 生物学特性

1.1 乳酸菌

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。

1．2 乳杆菌

Lactobacillaceae

细菌的一科。为革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌。分解糖的主要终产物是乳酸，不发酵乳酸盐，很少致病。广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内。该科仅包括乳杆菌属一属。该属细菌分解糖的能力强，分解蛋白质类的能力极低。乳杆菌耐酸，最适pH值为5.5～5.8，甚至更低。包括乳杆菌在内的乳酸菌在自然界中分布很广，在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中，均可分离到。中国传统的食品，如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等的制作保藏技术就是利用了乳酸菌的这一作用。

1.3 双歧杆菌

中文学名：双歧杆菌属

拉丁学名：(Bifidobacterium Orla-Jensen,1924)

形态描述：形态很不一致的杆菌，0.5～1.3 μm×1.5～8μm，常呈弯、棒状和分支状。单生、成对、V字排列，有时成链，细胞平行成栅栏状，或玫瑰花结状。偶尔呈膨大的球杆状。革兰氏阳性，通常染色不规则。不运动，不产芽孢，抗酸染色阴性，厌氧生长，少数几个种可在含10％CO2的空气中生长。pH低于4.5和高于8.5时不生长。化能有机营养。发酵碳水化合物活跃，发酵产物主要是乙酸和乳酸，二者的摩尔比是3∶2；不产生CO2。不产生丁酸和丙酸。接触酶阴性。通常要求多种维生素。最适生长温度是37～41℃。分离于温血脊椎动物的肠道、昆虫和垃圾；被认为与人的感染有关但通常认为其为非致病菌。

1.4 链球菌

链球菌 Streptococcaceae

细菌的一种。为革兰氏染色阳性，发酵葡萄糖主要产生乳酸的兼性厌氧球状细菌。包括5个属。广泛分布于自然界，从水、乳、尘埃、人和动物粪便以及健康人的鼻咽部皆可检出。根据细胞壁多糖抗原的不同，可分为A、B、C…V（缺I和J）20个群，其中对人致病的主要为A群，其他各群对动物致病。不溶血。链球菌一般不致病，常存在于粮食、乳品中，在乳制品、泡菜和粉丝的制做中起作用。明串珠菌属中的肠膜明串珠菌能从蔗糖产生葡聚糖，可作为代血浆。片球菌属由于耐酒精和酒花，常成为啤酒的为害菌，使啤酒混浊败坏。此外，还有气球菌属和孪生球菌属等。

1.5 明串珠菌

细胞球形或豆状，成对或豆状，成对或成链排列。革兰氏阳性，不运动，无芽孢。菌

落光滑、圆形、灰白色，直径一般小于1mm，液体中均匀浑浊，但长链状菌株可产生沉淀。

培养需复合生长因子烟酸、硫胺素、生物素和氨基酸，不需要泛酸及衍生物。兼性厌氧。温度范围5~30℃可生长，最适温度25℃.异型酸乳发酵。通常不酸化和凝固牛乳，不水解精氨酸，不水解蛋白，不还原硝酸盐，不溶血，接触霉反映阴性。

1.6 片球菌

细胞球形，成对或四联状排列。革兰氏阳性，无芽孢，不运动。无细胞色素。固体培养，菌落大小可变，直径1.0~2.5mm。

培养需复合生长因子烟酸、泛酸、生物素和氨基酸，不需要硫氨酸、对氨基甲苯酸和钴胺素。兼性厌氧。温度范围25~40℃可生长，最适温度30℃。同型乳酸发酵，通常不酸化和凝固牛乳，不分解蛋白质，不还原硝酸盐，不水解马尿酸钠，接触霉反应阴性。

2 检验所需器材

温箱：36±1℃。

冰箱：0-4℃。

恒温水浴：46℃±1℃。

电炉：可调式。

吸管：容量为1、10和25mL。

广口瓶或三角瓶：容量为500mL。

平皿：直径为9cm。

试管：18×180mm。

显微镜。

3 检验程序

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│检样│

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│作成几个适当倍数的稀释液│

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│选择2－3个适当稀释度各以lml之量加入│

│灭菌平皿内│

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│每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基│

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36士1℃│72士3h

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│菌落计数│

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│报告│

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4 操作方法

以无菌操作将经过充分摇匀的检验25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌

广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。

用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内(注

意吸管尖端不要触及管内稀释液)。

另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次, 即换用

1支1mL灭菌吸管。

选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸

管移1mL稀释液于灭菌平皿内, 每个稀释度作两个平皿。

稀释液移入平皿后, 应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入

平皿约15mL,并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用

的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照, 以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种

结果须在20min内完成。

待琼脂凝固后, 翻转平板, 置36±1℃温箱内培养72±3h取出, 观察乳酸菌菌落特征

(见表1),选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。

计算后, 随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色, 显微镜检查并做过氧化氢酶试验。

革兰氏阳性, 过氧化氢酶阴性, 无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸

菌菌落计算出

该皿内的乳酸菌数, 然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如,检样10~4的稀

释液在改良TJA琼脂平板上,生成的可疑菌落为35个,取5个鉴定, 证实为乳酸菌的是4个,

则1mL检样中乳酸菌数为: 4

35×--------- ×104 = 2.8×105

5

乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1

表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征

┌──┬─────────────────────┬───────────────────┐

││改良TJA │改良MC │

├──┼─────────────────────┼───────────────────┤

│杆菌│平皿底为黄色，菌落中等大小，徽白色，湿润，│平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，│

││边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落。│边缘似星状，直径2土1mm,可有淡淡的晕。

├──┼─────────────────────┼───────────────────┤

│球菌│平皿底为黄色，菌落光滑，湿润微白色，边│平皿底为粉红色、菌落较小，圆形，红色，│

││缘整齐。│边缘整齐，可有淡淡的晕。│

└──┴─────────────────────┴───────────────────┘

备注:干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑,边缘整齐,侧面呈菱形状。

5 乳酸菌的鉴定

对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时, 则作以下试验。

5.1 菌种制备：自平板上挑取菌落, 接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面, 于36±1℃, 24～48h培养, 刮取菌苔, 分别进行下列试验。

5.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐, 不液化明胶, 不产生靛基质和硫化氢。