谷氨酰胺合成酶

min，以质量分数为 1%的 KCl 溶液洗涤 2 次，得到湿菌体，放入-20℃
冰箱中保存，备用。
（2） 超声波破碎。融化冻存的菌体，加入 3 倍体积的浓度为 0.05
mol/L 咪唑-HC1 缓冲液(pH 值 7.0，含浓度 2 mmol/L 的 DTT，用于
保护酶蛋白的二硫键，免受超声波的破坏；含浓度 2 mmol/L 的 Mg
产品加工·学刊.2010(7):4~7 2.肖钢等.一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆 分析[J].湖北大学学报( 自然科学版).2010.9:326-329 3.Nakanishi T.Enzymes concerned in the conversion of L-glutamic acid fermentation to L-glutamine and N-acetyl-L-glutamine fermentation by Corynebacterium glutamicum [J] . Ferment Tech,1975,56(6) : 573-585 4.Shapiro B M,Stadtman E R.Glutamine sythetase （Escherichiacoli)[J].Methods Enzymol，1970，17 (4）:910-922．
2+ ，用于稳定酶活力），制成菌悬液，用超声波破碎器于冰浴中在功
率 400 W，工作 1 s，间歇 3 s 条件下处理 20 min。然后在温度 4℃，
转速 8 000 r/min 下离心 30 min，上清部分即为无细胞抽提液。
3、酶活测定[1]：反应总体积为 3 mL，1.6 mL 的反应混合液 （pH 值
酶液，混匀。于 37℃下保温 0.5 h。
加入显色液（含浓度 0.2 mol/L 的 TCA，0.37 mol/L 的 FeCl 3 和 0.6
mol/L 的 HCl 混合液）1 mL，终止反应并显色。空白对照采用上述反 应液体系，不加酶液蒸馏水补足反应体积。 在波长 540 nm 处比色测定形成的γ-谷氨酰羟肟酸。在上述条件下， 1 min 催化形成 1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需要的酶量定义为 1 个酶 活力单位，比活力为 U/mg 蛋白。
7.0）
0.1 mol/L 的 Tris- HCl
80mmol/L 的 Mg 2+
20 mmol/L 的谷氨酸钠盐
20 mmol/L 的半胱氨酸
2 mmol/L 的 EDTA
80 mmol/L 的盐酸羟胺
再加入 0.7 mL 的浓度 40 mmol/L 的 ATP 溶液，最后加入 0.7 mL 的粗
谷氨酰胺合成酶（GS）Leabharlann Baidu
1、培养条件：将菌株转接到斜面培养基上，在 30℃下培养 3 d，再
从种子培养基接种到产酶培养基上，摇床培养条件为 28℃下培养 36
h，液体培养摇床的转速为 160 r/min。
2、无细胞抽提液的制备
（1）菌体收集。菌株在摇床培养 36 h，在转速 8 000 r/min 下离心 20
A 计算公式为：GS 酶活力 = P V t
式中：A———540 nm 处的吸光度； P———粗酶液中可溶性蛋白含量，mg/mL； V———反应体系中加入的粗酶液体积，mL； t ———反应时间，h。
4、粗酶液中蛋白含量测定： 采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标准蛋白。 试剂： 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50mL 95% 乙醇中，然后加入 100mL 85%（w/v）磷酸，最后定容到 1 升。 测定： 将 10µL 待测样品用 90µL 蒸馏水稀释到 0.1mL，加到试管中，然后 加入 5mL 测定试剂，摇匀 2min 后在 595nm 下测光吸收值。 参照蛋白标准曲线，计算蛋白浓度，即 0.050 A 595 相当于 1mg/mL 的 蛋白浓度。 参考文献： 1.刘川顺，李平等.谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选及酶学性质[J].农