谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
细胞培养过程中谷氨酰胺检测方法汇总
细胞培养过程中谷氨酰胺检测方法汇总谷氨酰胺是一种基本的氨基酸,为其它氨基酸、脂类、细胞内蛋白质、抗体和核酸的合成提供碳源和氮源。
谷氨酰胺还可刺激抗体的转录后翻译过程。
在许多细胞的培养过程中,均发现了细胞生长对谷氨酰胺有依赖性,如在杂交瘤细胞培养过程中,谷氨酰胺浓度为零时,细胞快速死亡。
有一些细胞经过适应后,能在不含谷氨酰胺的培养基中生长,但细胞株之间的适应速率存在较大的差异。
细胞生长是否依赖于谷氨酰胺的关键在于细胞是否含有内源的谷氨酰胺合成酶,即是否具有将谷氨酸转化生成谷氨酰胺的能力;另外,谷氨酸的运输速率及谷氨酰胺的生成速率限制是导致细胞在无谷氨酰胺培养基中生长速率减慢的主要原因。
因此细胞培养中检测谷氨酰胺浓度具有重大价值，本文就目前常见的谷氨酰胺的检测方法做一个全面的汇总。
一、滴定法1.原理谷氨酰胺分子结构中既有羧基，又有胺基，但其酸碱性都较弱，故只有在非水溶剂中才能滴定其羧基或胺基。
为此，以乙酸（冰醋酸）为溶剂，用高氯酸滴定其胺基。
2电位滴定法称取预先在105℃干燥至恒重的样品0.15g ，精确至0.0001g ，置于干燥的烧杯中，加无水甲酸3mL 溶解后，再加入50mL 冰乙酸，用高氯酸标准溶液滴定，用电位滴定仪滴定至终点，滴定的结果用空白试验校正。
3.指示剂法取本品干燥品约0.15g ，精确至0.0001g ，加无水甲酸3mL 溶解后，加乙酸(冰醋酸)50mL ，加结晶紫指示液1滴，以高氯酸标准滴定溶液(0.1mol/L)缓缓滴定至显蓝色即为终点，记录滴定液消耗体积。
同法做空白试验，记录。
计算X%=()100100014.1460⨯⨯⨯-⨯m V V C 式中：X ——L-谷氨酰胺含量，%；C ——高氯酸标准滴定溶液浓度(mol/L)；V ——滴定样品时消耗高氯酸标准滴定液体积数(mL)；V 0——空白试验时消耗高氯酸标准滴定液体积数(mL)；m ——样品质量(g)；146.14——L-谷氨酰胺的摩尔质量（g/mol ）。
实验方法
谷酰胺合成酶（GS）提取测定酶液的制备缓冲液A：l00mmol/L Tris-HCl，pH7.6，含1.0mmol/L EDTA，l.0 mmol/L MgCl2.6H2O，10mmol/L 2-巯基乙醇)，用于粗酶提取。
取适量的叶片，置于冰浴的研钵(预先冷冻)中，加入少量石英砂研磨后，以每g鲜重材料加3ml抽提缓冲液进行匀浆。
匀浆液于Beckman高速冷冻离心机4℃下，12000r/min离心30min，取上清液，在冰浴中分装。
整个提取过程要将材料保持在低温条件下，且尽量快速的进行，以防止酶的失活。
GS合成酶活性的测定按文献(RhodesetaL，1975)报道的方法进行。
反应在pH7.2的咪唑缓冲系统中进行，反应总体积为2mL，包括合成酶活性反应液【配方为:50mmol/L咪唑—HCI，40mmo/LMgSO4·7H2O，90mmol/L谷氨酸，6mmoL/l羟胺lml，蒸馏水0.8ml，酶液0.lml】，最终的pH值为7.2。
在37℃预热2一3min后加入0.1ml10mmol/L的ATP溶液，立即启动反应。
混合均匀后，37℃保温15min，加入酸性FeC13终止液[2%(W/V)TCA，3.5%(W/V)FeC13·6H2O，2% HCl lml 终止反应，2500g离心5min，取上清液于540nm处用可见光分光光度计测定吸光值。
一个GS活性单位定义为每min于37℃产生1umol的γ一谷氨酞异羟酸(γ一glutamylhydroxmaate)所需的酶量。
谷氨酰胺合成酶活性的测定酶液提取：取4～5 片旗叶，去中脉及首尾部分，剪碎后称取0.5 g，加入6 ml（pH 8.0 ,50 mmol·L-1）的咪唑-HCl 缓冲提取液（含2 mmol·L-1 的MgSO4，0.5 mmol·L-1 EDTA，10mmol·L-1 β-巯基乙醇），冰浴研磨，4℃下15 000×g离心20 min，上清液即为酶液。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
酶化学
第五章酶化学一：填空题1.全酶由________________和________________组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中________________决定酶的专一性和高效率，________________起传递电子、原子或化学基团的作用。
2.辅助因子包括________________，________________和________________等。
其中________________与酶蛋白结合紧密，需要________________除去，________________与酶蛋白结合疏松，可用________________除去。
3.酶是由________________产生的，具有催化能力的________________。
4.酶活力的调节包括酶________________的调节和酶________________的调节。
5.T.R.Cech和S.Altman因各自发现了________________而共同获得1989年的诺贝尔奖(化学奖)。
6.1986年，R.A.Lerner和P.G.Schultz等人发现了具有催化活性的________________，称________________。
7.根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可以分为六大类________________，________________，________________，________________，________________和________________。
8.按国际酶学委员会的规定，每一种酶都有一个唯一的编号。
醇脱氢酶的编号是EC1.1.1.1，EC代表________________，4个数字分别代表________________，________________，________________和________________。
9.根据酶的专一性程度不同，酶的专一性可以分为________________专一性、________________专一性和________________专一性。
GS和GOGAT酶活性测定
实验报告（修改中勿动）9月8日张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μm ol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml 的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）←以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
GS GOGAT 的测定
提取缓冲பைடு நூலகம்：
0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4 7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；
反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4 7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；
40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
请问反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；到底是加多少体积的盐酸羟胺啊？而且盐酸羟胺是酸性的，加进去PH肯定会变化。急！
反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；
显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：
3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3 6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；
二
三
四
五
六
七
八王月福
碳氮代谢测定
谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。
淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
生物化学酶习题及答案
第七章酶化学一、填空题1.全酶由________________和________________组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中________________决定酶的专一性和高效率，________________起传递电子、原子或化学基团的作用。
2.酶是由________________产生的，具有催化能力的________________。
3.酶的活性中心包括________________和________________两个功能部位，其中________________直接与底物结合，决定酶的专一性，________________是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。
4.常用的化学修饰剂DFP可以修饰________________残基，TPCK常用于修饰________________残基。
5.酶促动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法)，得到的直线在横轴上的截距为________________，纵轴上的截距为________________。
6.磺胺类药物可以抑制________________酶，从而抑制细菌生长繁殖。
7.谷氨酰胺合成酶的活性可以被________________共价修饰调节；糖原合成酶、糖原磷酸化酶等则可以被________________共价修饰调节。
二、是非题1.[ ]对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。
2.[ ]酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。
3.[ ]酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。
4.[ ]Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
5.[ ]当[S]>> Km时，v 趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加v。
6.[ ]酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间长，则最适温度高，作用时间短，则最适温度低。
7.[ ]增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。
谷氨酰胺合成酶活性测定
谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
谷氨酰胺合成酶(GS)检测
迪信泰检测平台
谷氨酰胺合成酶（GS）检测
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）是高等植物氮代谢中的关键酶，能催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，参与氨同化过程，不仅可以防止铵离子过多造成的生物毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式，谷氨酰胺合成酶活性可作为衡量植物氮素同化水平的一项重要生理指标。
测定原理：谷氨酰胺合成酶在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨
酰胺，谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色
的络合物，产物在540nm处有最大吸收峰，通过吸光值的变化即可表征谷氨酰胺合成酶的活性。
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1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
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1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 谷氨酰胺合成酶活性信息。
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lt5 酶化学 生物化学习题汇编
目录第五章酶化学 (2)一、填充题 (2)二、是非题 (3)三、选择题 (4)四、简答题 (6)第五章酶化学一、填充题1、全酶由( )和( )组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中( )决定酶的专一性和高效率，( )起传递电子、原子或化学基团的作用。
2、辅助因子包括( )，( )和( )等。
其中( )与酶蛋白结合紧密，需要( )除去，( )与酶蛋白结合疏松，可用( )除去。
3、酶是由( )产生的，具有催化能力的( )。
4、酶活力的调节包括酶( )的调节和酶( )的调节。
5、T. R. Cech和S．Alman 因各自发现了( )而共同获得1989年的诺贝尔奖(化学奖)。
6、1986年，R. A. Lerner 和P. G. Schultz等人发现了具有催化活性的( )，称( )。
7、根据国际系统分类法，所有的酶按所摧化的化学反应的性质可以分为六大类( )、( )、( )、( )、( )和( )。
8、按国际酶学委员会的规定，每一种酶都有一个惟一的编号。
醇脱氢酶的编号是EC 1.1.1.1，EC代表( )，4个数字分别代表( )、( )、( )和( )。
9、根据酶的专一性程度不同，酶的专一性可以分为( )专一性、( )专一性和( )专一性。
10、关于酶作用专一性提出的假说有( )、( )和( )等几种。
11、酶的活性中心包括( )和( )两个功能部位，其中( )直接与底物结合，决定酶的专一性，( )是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。
12、酶活力是指( )，一般用( )表示。
13、通常讨论酶促反应的反应速度时，指的是反应的( )速度，即( )时测得的反应速度。
14、常用的化学修饰剂DFP可以修饰( )残基，TPCK常用于修饰( )残基。
15、酶反应的温度系数Q10一数为( )。
16、调节酶包括( )和( )等。
17、解释别构酶作用机理的假说有( )模型和( )模型两种。
18、固定化酶的优点包括( )，( )，( )等。
生物化学酶习题及答案
第七章酶化学一、填空题1.全酶由________________和________________组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中________________决定酶的专一性和高效率，________________起传递电子、原子或化学基团的作用。
2.酶是由________________产生的，具有催化能力的________________。
3.酶的活性中心包括________________和________________两个功能部位，其中________________直接与底物结合，决定酶的专一性，________________是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。
4.常用的化学修饰剂DFP可以修饰________________残基，TPCK常用于修饰________________残基。
5.酶促动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法)，得到的直线在横轴上的截距为________________，纵轴上的截距为________________。
6.磺胺类药物可以抑制________________酶，从而抑制细菌生长繁殖。
7.谷氨酰胺合成酶的活性可以被________________共价修饰调节；糖原合成酶、糖原磷酸化酶等则可以被________________共价修饰调节。
二、是非题1.[ ]对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。
2.[ ]酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。
3.[ ]酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。
4.[ ]Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
5.[ ]当[S]>> Km时，v 趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加v。
6.[ ]酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间长，则最适温度高，作用时间短，则最适温度低。
7.[ ]增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。
谷氨酰胺合成酶测定
谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定一、实验原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1protein·h﹣1。
二、实验仪器与用具冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）三、实验试剂（1）提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0）。
内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；（2）反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。
称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；（3）反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）。
反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；（4）显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）。
生物化学酶习题及答案
第七章酶化学一、填空题1.全酶由________________和________________组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中________________决定酶的专一性和高效率，________________起传递电子、原子或化学基团的作用。
2.酶是由________________产生的，具有催化能力的________________。
3.酶的活性中心包括________________和________________两个功能部位，其中________________直接与底物结合，决定酶的专一性，________________是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。
4.常用的化学修饰剂DFP可以修饰________________残基，TPCK常用于修饰________________残基。
5.酶促动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法)，得到的直线在横轴上的截距为________________，纵轴上的截距为________________。
6.磺胺类药物可以抑制________________酶，从而抑制细菌生长繁殖。
7.谷氨酰胺合成酶的活性可以被________________共价修饰调节；糖原合成酶、糖原磷酸化酶等则可以被________________共价修饰调节。
二、是非题1.[ ]对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。
2.[ ]酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。
3.[ ]酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。
4.[ ]Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
5.[ ]当[S]>> Km时，v 趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加v。
6.[ ]酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间长，则最适温度高，作用时间短，则最适温度低。
7.[ ]增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。
转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力
转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力【摘要】转PnAlaAT3基因是提高杨树在低氮条件下叶谷氨酰胺合成酶活力的重要因素。
本研究旨在探讨转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响及其在杨树生长过程中的意义。
经过一系列实验发现，转PnAlaAT3基因显著提高了杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，从而增强了杨树在低氮条件下的生长能力。
通过材料与方法、结果分析和讨论等部分对实验结果进行了深入阐述，并得出了结论：转PnAlaAT3基因能够有效增加杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，对杨树生长具有重要意义。
展望未来，本研究可为进一步优化杨树栽培提供理论依据。
实验结果表明，转PnAlaAT3基因是提高杨树在低氮条件下叶谷氨酰胺合成酶活力的有效途径。
【关键词】关键词：转PnAlaAT3基因、杨树、叶谷氨酰胺、合成酶活力、低氮条件、生长、研究、意义、结果分析、讨论、实验结果、结论、展望。
1. 引言1.1 研究背景转PnAlaAT3基因可提高低氮条件下杨树上位叶谷氨酰胺合成酶活力的研究背景：本研究旨在通过转PnAlaAT3基因的方式，探讨其对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响，以期为提高杨树在低氮条件下的生长适应性提供新的思路和方法。
通过这一研究，可以增加对杨树氮素吸收和利用机制的了解，为未来的遗传改良和育种提供参考和借鉴。
1.2 研究目的本研究的目的是探究转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响。
由于氮素是植物生长发育过程中必需的营养元素之一，然而在许多土壤中氮素含量不足，这对植物的生长和发育造成了影响。
了解植物在低氮条件下的适应机制对于提高植物的氮利用效率具有重要意义。
杨树是一种常见的速生树种，具有快速生长和较高的氮利用效率的特点。
本研究旨在通过转PnAlaAT3基因来提高杨树叶谷氨酰胺合成酶活力，进而增强杨树在低氮条件下的生长适应能力。
通过研究转PnAlaAT3基因对杨树叶谷氨酰胺合成酶活力的影响，可以为进一步优化杨树氮利用效率提供理论基础和实践指导。
水稻营养生长期谷氨酰胺合成酶活性杂种优势初步研究
（ ）谷氨酰胺 台成酶 活性测定 参考李 合生《 物生理 ３ 植 生化实验 原理 和 技术 》 ， 每样 品重 复 ３次 测定 ， 平 均 求
物技 术 研 究 所 实 验 室 里 进 行 。
益 的进展 。然 而 ， 国际 国内对水稻 营养生长期 杂 种优 势 分 析与预测作 用 的研 究 中 ， 注重基 因型差异 方面 和产 量 多 优 势方面 的研 究 ， 而较 少 涉及 生 理方 面 ， 别 是酶 的活性 特
方 面 ．由于作 物产量是 由基 因和环境众 多 因子 相互作 用 、
面 的 一种 指 标 。
关键 词 ： 水稻 ； 杂种优势 ； 谷氨酰胺合成酶； 营养生长期
中 图 分类 号 ｓ ｌ．０ ５ １１３ 文 献标 识 码 Ａ 文章编号 １０ ７ ３ （０８ ０ ７ ０ ０ ７— ７ １２ ０ ）７— ４— ２
杂种优势 是生物 界的普遍 现象 ， 利用 杂种优 势培 育高
个高 氮 素 吸 收 和 利 用 率 的 品种 （ 广恢 １ ８ 长 伦 占， 秀 ２， 矮
氮素 利用效率 的耐低 氮杂交 水稻品种 可降低 氮肥 施用 量 ， 是有效 地利用 化肥 资源 、 减少 环境 污 染 、 降低 生产 成 本 和提 高稻米 品质 的重要举 措 ． 年来 ， 了选 育 高效 利 近 为 用氮 素的杂交 水稻新 品种 ， 国际水 稻所 从 ２ 纪 ８ 代 ０世 ０年 起连续 多年研 究杂交 水 稻高 氮 素利 用 效率 杂 种优 势 分析
（ ）第二 步 ： ２ ２ ９月 ３日把各 样 品均 分成 三份 ， 干净 洗
泥士 ， 用剪 刀 剪 去 大部 分 的 根 ， 样 品 分 别 培 养 在 高氮 各
势 形成机制 及早期 预测 方 法 ， 行 了大 量工 作 ， 进 展 仍 进 但
GOGAT活性的测定
提取液同GSGOGA T活性的测定反应混合液包括0.4ml 20mmol／L的L-谷氨酰胺，0.5ml 20mm／L的α-酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，总体积3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)补足(1.5m1)。
反应启动后，用752外可见分光光度计于340nm处每30s测定1个消光值，连续测定10次，取光密度稳定减小的段来衡量酶活性。
一个GOGA T活性单位定义为在该反应条件下，每分钟反应混合液减少1μmolNADH为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的测定酶液的提取酮同GS。
活性测定参照Lin（1996）的方法，反应混合物中包括0.3ml0.1mMα－酮戊二酸，0.3ml1MNH4Cl，0.2ml3mMNADH和1ml酶提取液，不足的体积用0.2MTris-HCl buffer补足，反应由酶液启动，340nm下测定消光值的变化。
以每分钟0.001消光值的下降作为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的测定测活贮备液:115.4mmol/L Tris HCL(Ph8.0)，23.1mmol/L 2-酮戊二酸，231mmol/LnNH4CL。
NADH贮备液:6mmol/LCaCI:贮备液:30 mmol/L先在准备好的试管中加入2.6mL测活贮备液，按顺序加入0.1mLCaC12，0.lmLNADH，0.1mL 蒸馏水。
再加入0.1ml酶液启动反应，并于34Omn处测定吸光值，三分钟后再测定一次，计算差值。
以水代替NADH和酶液作为空白对照管。
NADH一GDH活性以每分钟在30℃下氧化1umol的NADH所需的酶量为为一个酶活性单位。
谷氨酸脱氢酶（GDH）活性测定参照黄维南方法[6],并稍有修改。
反应体系中含有0.1 M Tris-HCl,pH 8.2, 0.33 Mα-酮戊二酸,3 M NH4Cl,1mM NADH。
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谷氨酰胺合成酶活性的测定
一．试剂
（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）
称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液
1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）
除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）
称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液
称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤
（1）粗酶液的提取
取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液
（2）GS活性的测定
取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
三．结果处理及计算
GS活性[A540/(g·h）]=
A540为540nm处的吸光度；
m 为样品质量（g）；
Vt为粗酶液总体积（mL）；
Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）；
t 为反应时间（h）。