谷氨酰胺合成酶测定

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谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定

一、实验原理

谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一,在ATP 和Mg2+存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在540nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示,单位A·mg﹣1protein·h﹣1。二、实验仪器与用具

冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml、1ml)

三、实验试剂

(1)提取缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl,pH8.0)。内含2mmol/L Mg2+,2mmol/L DTT,0.4mol/L蔗糖。称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g,0.1245g MgSO4·7H2O,0.1543g DTT(二硫苏糖醇)和34.25g 蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl(0.1mol/L = 1ml的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里)调至pH8.0,最后定容至250ml;

(2)反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲,pH7.4)。内含80mmol/L Mg2+,20mmol/L谷氨酸钠盐,20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。称取3.0590g Tris,4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠

盐,0.6057g半胱氨酸,0.1920gEGTA,去离子水溶解后,用0.1mol/L HCl调至pH7.4,定容至250ml;

(3)反应混合液B(含盐酸羟胺,pH7.4)。反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺,pH7.4;

(4)显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液)。

3.3176g TCA(三氯乙酸),10.1021g FeCl3·6H2O,去离子水溶解后,加5ml浓盐酸,定容至100ml;

(5)40mmol/L ATP溶液。称取0.1210g ATP溶于5ml去离子水中(临用前配制)

四、方法步骤

1.粗酶液提取

称取植物材料0.5-1g与于研钵中,加3ml(实际情况作调整)提取缓冲液,置冰浴上研磨匀浆,转移于离心管中,4℃下12,000r.min-1离心20min,上清液即为粗酶液。

2.反应 1.6ml反应混合液B,加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液,混匀,于37℃下保温半小时,加入显色剂1ml,摇匀并放置片刻后,于5,000 r.min-1下离心10min,取上清液测定540nm处的吸光值,以加入1.6ml反应混合液A的为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定

取粗酶液0.5ml,用水定容至100ml,取1ml用考马斯亮蓝G-250测

定可溶性蛋白质(方法待定,试着不用定容直接测,即取样品液1ml,如蛋白含量高,再适当稀释,加考马斯亮蓝5ml,在595nm下测定吸光值,注意应放置10min后在测,在1h内比色完)

4.结果计算

GS活力=A/(P.V.T)

式中

A—540nm处吸收值

P---粗酶液中可容性蛋白的质量浓度(mg/mL)

V---反应体系中加入的粗酶液体积(mL)

T---反应时间

GS活力是以每毫克酶蛋白在每小时催化生成的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合的产物在540nm处的吸光值的大小来表示

注意:在测酶时,由于各酶活力大小的表示都是以每小时/min产生生成一定量的产物的量来表示,不同的时间长度产生产物的量不同,所以在测量时,要严格控制时间,要保证测同一指标的各批次材料在处理时间(反应时间)要严格一致!!!

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