海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用

海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用
摘要:为了预防和控制大规模爆发的鱼类病毒性疾病,海水鱼类细胞系已成为研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要体外培养体系。

本文详细总结了海水鱼类细胞系的原代培养步骤、培养体系和细胞系的建立、鉴定的实验步骤,并对海水鱼类细胞系在鱼类病毒学等研究工作中的作用加以综述。

关键词:细胞系海水鱼类鉴定病毒应用
引言
21世纪是海洋经济的时代,以海水鱼类养殖业为代表的第四次海水养殖浪潮的展开,给中国水产界带来了巨大的经济和社会效益。

但随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀,各种病毒性疾病开始大规模爆发,给鱼类养殖业造成了巨大的经济损失。

为了查清鱼类病毒的感染途径和感染机理,从根本上预防和解决病毒病的传播,鱼类细胞系被广泛应用于鱼类病毒的分离鉴定、病毒病的诊断及病毒与宿主细胞的相互作用机理等研究,成为研究病毒学、细胞毒理学、细胞工程等多种学科的重要体外研究体系[1,2]。

自Wolf和Quimby建立世界上第一株鱼类细胞系——虹鳟鱼生殖腺细胞系[3]以来,鱼类细胞培养与建系研究发展迅速。

尽管淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞培养和细胞系建立发展较快,但目前建立并广泛应用的海水鱼类细胞系数量较少,主要来源于牙鲆[4]、大菱鲆
[5]、鲈鱼[6]、真鲷[7]、石斑鱼[8-9]等几种经济鱼类,仍迫切需要建立多种细胞系用于多种学科的研究。

因此,本文就海水鱼类细胞系的建立、鉴定方法及其应用展开综述。

1 海水鱼类组织原代培养及细胞系建立的基本方法
1.1 原代培养组织来源及培养方法
海水鱼类组织原代培养及细胞系建立基本沿用了哺乳动物的细胞培养方法,与淡水鱼类细胞的培养方法也基本类似。

首先选取合适的组织进行原代培养。

根据目前研究显示,海水鱼的各种组织包括分化程度低,分裂潜能大的胚胎和幼鱼组织,以及成鱼性腺、肾脏、心脏、脾脏、鳔、鳍、吻端乃至肿瘤等组织,均可进行原代培养。

从鱼体获取目的组织消毒处理后,一般直接剪成1mm3的组织块于培养瓶中贴壁培养。

胚胎(干)细胞一般采用撕开受精卵卵膜、释放出细胞团块、吹打获得单个游离细胞的方法启动原代。

若组织中存在较多细胞外基质成分或脂类物质,可在获得组织块后采用酶消化法进行处理。

目前建立的海水鱼类细胞系仍多使用非特异性的胰酶进行消化处理,但也有利用胶原酶、透明质酸酶等特异性酶对组织块进行消化处理并建成细胞系的报道。

酶消化过程中可以通过控制酶浓度和对组织的处理时间,达到疏松组织,组织块贴壁培养法启动原代;还可直接将组织消化成单个游离细胞,过滤离心收集游离细胞启动原代培
养。

1.2 细胞最适体外培养体系的确定和细胞系的建立
在细胞培养过程中,能否建立适合细胞体外生长的培养体系是细胞系建立成功与否的关键。

在海水鱼类细胞培养中,通常使用化学合成培养基,包括Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM);Leibovitz’s L-15 Medium;Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(1:1)powder(DMEM/F12);Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM);Medium 199等等。

为了促进细胞贴壁和生长,往往在此基础上添加一些天然成分,如血清、生长因子、氨基酸及各种促贴壁物质。

胎牛血清或小牛血清中含有增殖因子、附着因子、营养物质和蛋白质消化阻止因子等,可以调节体外细胞培养环境,促进细胞贴壁和生长,还可以保护细胞免受脂肪酸和重金属离子蛋白酶等物质的损害,在一般的鱼类细胞培养中均需添加,添加量为10%～20%。

另外,在某些特殊组织的培养中,还可根据需要添加鱼血清,以取得良好效果。

鱼类细胞培养中常添加细胞外基质成分作为促贴壁物质,如羧甲基壳寡糖和N-乙酰葡萄糖胺等,它们能通过整联蛋白介导细胞与培养介质之间形成锚定连接,促进细胞贴壁。

鱼类细胞培养中常用的细胞生长因子有碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和胰岛素样
细胞生长因子(insulin-like growth factor,IGF)等。

bFGF和EGF主要通过与酪氨酸激酶性受体结合,激活了受体的酪氨酸激酶活性,使ras蛋白被激活,进而激活了细胞内MAP激酶的级联反应链,来刺激细胞增殖。

IGF是进化上相当保守的多肽,具有调节细胞代谢、促进细胞生长、分化和分裂,抑制细胞凋亡等作用。

由于鱼类适应温度范围广,故海洋经济鱼类细胞系的培养温度在18℃～28℃范围内均可选择。

目前所建立的细胞系所用pH值一般在6.8～7.6内均可,多为7.2～7.4。

一般不用特别考虑渗透压。

鱼类细胞在最适培养体系下长成单层后,一般采用胰酶消化法处理细胞,胰酶的浓度和消化时间根据具体细胞情况摸索得到。

将细胞吹打收集,悬浮均匀后分别接种至两个培养瓶中,在最适培养液配方和培养条件下继续进行传代培养,直至细胞系建立。

根据本文总结,目前国内外已建成海水鱼类细胞系79株,分别属于18科35种鱼类,充实了鱼类细胞系的研究体系,在鱼类病毒学,环境毒理学,鱼类遗传学、免疫学和功能基因组学等方面起到了重要的作用。

2 海水鱼类细胞系的鉴定
鱼类细胞系建立后,一般采取与哺乳动物细胞系相同的方法对细
胞系进行鉴定。

主要包括测定细胞生长曲线、细胞群体倍增时间;染色体计数与核型分析等等,目前还常用分子手段鉴定细胞的种属来源;采用免疫学方法利用特异性抗体鉴定细胞的组织来源。

3 海水鱼类细胞系的主要应用
鱼类病毒学是鱼类细胞系建立后最主要的应用领域。

随着世界范围内海水鱼类养殖业的发展,各种养殖病害特别是病毒性传染病日益加剧,已造成重大的经济损失。

迄今,已发现的鱼类病毒有70多种,在我国主要有牙鲆弹状病毒、淋巴囊肿病毒、传染性胰脏坏死病毒等等。

对于病毒病的预防和控制需要获取包括病毒传播机制、病毒与宿主之间的相互作用及宿主细胞的防御机制等足够的信息并确定应对对策。

鱼类细胞系以其操作方便,性质稳定,对比明显等特点,在鱼类病毒病防治方面起到了至关重要的作用。

目前,主要利用海水鱼类细胞系进行病毒的分离和鉴定,病毒的体外繁殖和制备病毒疫苗,以及研究病毒与宿主细胞的相互作用关系等方面研究。

4 讨论与前景展望
鱼类细胞培养技术经过多年的发展,已经取得了一定的成果。

鱼类细胞系已经成为水产养殖中控制病害的最有用的体外研究体系。

但
是,目前鱼类细胞系特别是海水鱼类细胞系资源不足,多种经济鱼类还没有细胞系建立的报道,而已建立的细胞系的应用远远不能达到要求,是当前基础研究中存在的重要瓶颈。

目前鱼类细胞系原代培养和建系技术多种多样且不完善,一般需要组织来源和组织的相应特性选择合适的方法。

缺乏通用的标准,且已建立的海水鱼类细胞系中仅有几株细胞系被收入权威细胞库中(如ATCC或ECACC)。

应该建立一种专门的培养液,最好为标准化无血清培养液,此培养液可适用于多种鱼类细胞系,避免了繁琐的体外培养体系摸索过程,且可以对下游的免疫学和毒理学等研究减少干扰。

在鱼类病毒学方面,目前已经建立的海水鱼类细胞系多为对少数病毒敏感或不敏感,没有对病毒的普遍敏感性,远远不能解决目前日益严重的鱼类病毒病。

目前新发现的海洋鱼类病毒的鉴定和繁殖仍然多使用淡水鱼类的细胞系。

由于利用鱼类细胞系繁殖病毒和研制病毒疫苗的工作量大,难度大,许多实验室在此类研究中投入的精力还很不够,甚至无法建立实验室规模的病毒灭活疫苗生产线。

且鱼类细胞的群体倍增时间较哺乳动物长,且目前还没有发现可以悬浮培养的鱼类细胞系。

若能缩短鱼类细胞群体倍增时间和促使传代细胞系在悬浮培养条件下增殖,将大大推进病毒抗原的大规模生产。

目前,人们对于鱼类病毒病的控制和防治不但需要保护水产养殖动物的健康,防止因病毒病产生的大量减产对经济产生损失,还需要保护人类的健康,防止水产养殖产品带来的潜在风险。

亟待建立多种海
水经济鱼类细胞系,在鱼类病毒学等研究领域取得突破。