稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

中的作用提供细胞模型。

方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。

结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。

结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。

【关键词】核仁素；H9C2细胞；基因转染
Abstract Objective:To establish H9C2 cell line that can stably express the nucleolin,whi ch can provide a cell line with which we can analyze the function of nucleolin in apopto sis of cardiomyocytes.Methods:The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was transfected into H9C2 cells with lipofectin,the stable transfectants screened by G418 and the expression of nucleo lin was identified and analyzed by RT-PCR and Western blot.The pCMV-Tag2B-Nuc plas mid was confirmed by double-enzyme digestion and sequencing.Results:After G418 screeni ng, compared with the control group,the mRNA and protein of nucleolin in transfected cel l line were highly expressed, as demonstrated by the RT-PCR and Western blot analysis.C onclusion:The rat H9C2 cell line stably expressing nucleolin was successfully constructed.
Key words Nucleolin; H9C2 cell line; Gene transfection
近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生发展与细胞增殖和凋亡有关。

细胞凋亡的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。

核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。

另有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。

因此，本研
用提供理想的细胞模型。

1 材料与方法
1.1 材料
质粒pCMV-Tag2B-Nuc由德国Hamburg-Eppe大学细胞生物化学与临床神经生物学研究所Stefan Kindler教授惠赠；H9C2细胞株由中南大学细胞中心提供；DMEM培养基，Gibc o公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invit rogen life technologies公司产。

鼠抗C23单克隆抗体，Santa Cruz公司产；质粒抽提试剂盒，大连TaKaRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，Gibco BRL公司产。

1.2. H9C2细胞培养
大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。

3 质粒扩增、抽提及鉴定
质粒转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆进行扩增；质粒抽提依试剂盒说明书进行；用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒，一部分1％琼脂糖胶电泳，拍照；另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。

1.4 脂质体转染
根据生命技术公司提供的转染操作说明书进行。

细胞用无血清DMEM培基洗涤3次后，加入质粒与脂质体的混合物，37 ℃，5%的CO2培养箱中培养，6 h后再加入4 mL含10%小牛血清的DMEM培基，24 h后，按1∶10进行分瓶培养。

第2 d加入含1 000 μg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选4周。

同时转染pCMV-Tag2B空载体，用G418进行同样筛选后用于对照。

1.5 免疫印迹
按实验室常规方法进行。

用2×SDS裂解缓冲液裂解细胞，收集细胞总蛋白质，采用Bra dford法进行蛋白定量，30 μg蛋白经10%～12% SDS-PAGE电泳6 h后，电转（4 ℃，过夜）至PVDF膜，2%BSA室温封闭3 h，先后加入靶蛋白抗体及HRP标记的相应IgG，室温分别孵育1 h和0.5 h，DAB显色试剂盒进行显色。

1.6 细胞总RNA提取
按实验室常规方法进行。

弃培养液，加1 mL Trizol/2×106细胞，裂解细胞，细胞裂解物转移到2 mL Eppdorf管中，室温放置5 min，加0.2 mL氯仿/1 mL Trizol，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，4 ℃离心，细胞裂解液分为三层，小心吸取上层水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，加0.5 mL异丙醇/1 mL Trizol，室温放置10 min，4 ℃离心，小心去掉上清，加1 mL 75％乙醇洗白色沉淀物，离心后去掉乙醇，空气干燥约10 min，用10 μL～20 μL DEPC处理过的水重悬RNA，测量1∶100稀释样品的光密度（OD260）来计算浓度。

浓度（μg/mL）=(稀释度)［（40 μg/mL.OD260）］(样品的OD260)，重悬的RNA放置-80℃冰箱保存。

1.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
用逆转录酶MMLV合成第一链。

根据公司提供的使用说明书进行。

取1 μg RNA与oli gDT在70℃反应5 min，置于冰上，加入dNTP、buffer、Rnasin，37 ℃反应5 min后置
于冰上；加入MMLV，42℃反应1 h，72 ℃反应10min。

用2.5 μL的逆转录产物作为模板，按如下的反应条件进行PCR扩增：
C23：F:cgcggatcccatggtgaagctcgc；B：cggggtacctattcaaacttcgtcttct
94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，扩增31个循环；
GAPDH：F：acccagaagactgtggatgg B：ttctagacggcaggtcaggt
94 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，扩增22个循环。

2 结果
2.1 质粒鉴定
质粒pCMV-Tag2B-Nuc经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，产物在一部分1％琼脂糖胶电泳，另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。

将未经酶切质粒与质粒酶切产物均行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

酶切产物出现约2.1 kb大小片段，大小与预期一致。

测序结果与GenBank中公布的序列符合（测序结果未展示）。

2.2. 核仁素mRNA在H9C2细胞中的表达
以细胞的总RNA为模版，以特异性的引物经RT-PCR扩增出大小约为2.1 kb的片段，其长度与预期一致(见图2)，稳定表达核仁素的H9C2细胞RNA表达水平较野生型与转空载体细胞明显增高，以GAPDH作为内对照。

2.3. 核仁素在H9C2细胞中的表达
经Western blot检测，转pCMV-Tag2B-Nuc细胞与野生型细胞和转空载体细胞相比，核仁素表达水平明显升高(见图3)。

3 讨论
细胞凋亡在生物体的胚胎发育、器官形成等生理状态，以及神经退形性变、肿瘤发生、脑梗死、心衰等病理过程中均起重要作用［４］。

作为一种定位于核仁的磷酸蛋白，核仁素在细胞凋亡中的作用一度被忽视，但随着其功能的不断发掘，核仁素在细胞凋亡中的作用越来越突出，已被列为细胞凋亡相关蛋白中的一员［２。