第二章 酶学基础2

2、Klenow聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌 蛋白酶处理，可以产生大小不同的两个片段。 其中的大片段称为Klenow片段（由Klenow等人 于1970年报道），分子量为76 kD 。Klenow聚 合酶仍具有两种催化活性：①5’→3’聚合酶 活性，可以合成DNA；②3’→5’外切酶活性，可 从3’端降解DNA；但是它失去了5’→3’外切 酶活性。 在DNA克隆中，Klenow酶的主要用途有：通过聚 合作用填补或标记DNA的3’隐蔽末端，催化合 成cDNA的第二链；DNA序列测定。
DNA聚合酶Ⅰ的主要用途是通过DNA缺口平移 的方法制备DNA探针，用于核酸杂交分析，如图 所示。图中，双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶Ⅰ 的5’→3’外切活性作用下，从缺口的5’端逐 步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’ 游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向 下游移动，这种缺口移动的现象称为缺口平移。 如果反应中使用的单核苷酸底物是用同位素标记 过的，则合成产生的DNA分子即可作为带放射性 标记的DNA分子杂交探针。
1） 细菌的碱性磷酸酯酶BAP （bacterial alkaline phosphatase） 2 ）小牛肠的碱性磷酸酯酶CIP （calf intestinal alkaline phosphatase）
2 共同特性是能够催化核酸分子移去其末端5’ 磷酸基团，2个末端之间就不再能环化。
CIP比BAP实用，原因不耐热，比活性高10－ 20 倍。 3 应用程序见图
2
特 性
1）需要一条DNA链的3’－末端具有一个游 离的羟基（－OH），另一条5’－末端具有 一个磷酸基团（－P） 2）被连接的DNA链必须是双螺旋分子的一部 分，实际上连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上 的缺口（nick），而不是封闭裂口（gap） 3）提供能量
３）提供能量 在大肠杆菌及其细菌中，DNA连接酶催化 的连接反应，是利用NAD＋作能源的。 在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP作 能源。 这样连接酶有两种来源一种是由大肠杆菌 染色体编码的叫做DNA连接酶。另一种是由大 肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。 作用机理没有什么差别。
续进性），可以连续合成数千个核苷酸，是目前 已知持续合成能力最强的DNA聚合酶，这种高续 进性得益于硫氧还蛋白的辅助作用，使得基因5 蛋白与模板的亲合能力增强。除聚合活性以外，
T7 DNA聚合酶还具有ຫໍສະໝຸດ Baidu链及双链的3’→5’核酸
外切酶活性（由T7噬菌体基因5所编码）。类似 于T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶的3’→5’核 酸外切酶活性也很强，约为Klenow酶的1000倍。 T7 DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性。
2 连接 1）先5’－末端磷酸化， 然 后用T4DNA连接酶将 linker与片段连接上
2）用限制酶切，产生互补 的粘性末端， T4DNA连接酶将片段 与载体连接。
3
如 点含果 缺 有待 点 与克 所隆 加的 的 衔 接片 物段 相或 同基 的因 限内 制部 位也 DNA

可 实 现 定 向 克 隆
T4 DNA聚合酶可以用来标记DNA平末端或 隐蔽的3’末端。但反应必须在高浓度的dNTP 存在下进行，以使5’→3’聚合反应压倒强 劲的3’→5’外切活性，出现DNA净合成反应， 从而补平缺口。
对于3’突出末端的DNA分子进行末端标 记，则分两步进行。首先利用3’→5’外 切活性切除3’端突出尾，从而产生3’凹 端，然后在高浓度的某一种放射性同位素 标记的dNTP存在下，外切降解反应与dNTP 搀入的合成反应达到平衡，进而在T4 DNA 聚合酶的聚合活性催化下，利用高浓度的 dNTP逐渐取代的原有的核苷酸，这种反应 称为取代合成。应用取代合成法可以给平 末端的DNA片段或具有3’隐蔽末端的DNA片 段作末端标记。
+

温度 一般为4－15℃ 比较合适
O/N
6 影 响 因 素

ATP浓度1-10 umol/L

平 1-2U T4DNA连接酶 粘0.1U 插入片段/载体分子的摩尔比值

片段比载体应多
第三节 其它几种常用的工具酶
一
DNA聚合酶（DNA polymerase）
催化以DNA为模板合成DNA的反应，在DNA 重组技术中用于DNA的体外合成。经常使用的 DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）、 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（Klenow 酶）、T4DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶，末端 核苷酸转移酶以及反转录酶等。这些DNA聚合酶 的共同特点在于：它们都能够把脱氧核糖核苷 酸连续地加到双链DNA引物链的3’-羟基末端上， 催化核苷酸的聚合，形成新的DNA链。
与缺口转移制备DNA探针的方法相比， T4 DNA聚合酶催化的取代合成法制备探针 具有两个明显的优点：第一，不会出现缺
口转移法中可能产生的发夹结构；第二，
经适当的限制性核酸内切酶切割后可以很 容易地转变成链特异性探针。
应当注意的是，取代合成法不能够均匀标 记整条DNA链，也难以标记片段中部的核苷酸， 这一点与切口平移法完全不同。由于T4 DNA聚 合酶的3’外切酶活性并无序列特异性，在它 的作用下，所有DNA片段长度减少的速度都基 本相同；同时由于3’核酸外切酶的活性降解 单链DNA的速度比降解双链DNA的快得多，因此 当降解到中点时，一条限制片段将会分离成两 个半长的单链，随后迅速地被完全降解，所以 及时终止外切反应对于成功的末端标记是十分 重要的。
4 粘性 末端 DNA 片段 的连 接

常规方法
存在问题 碱性磷酸酯酶


常规方法
具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，用 两种连接酶都可完成此过程。
存在问题
由限制酶产生的具有粘性末端的载体 DNA分子，会自我环化作用。给筛选工 作带来麻烦，假阳性比率高。
1 碱性磷酸酯酶有两种
碱性 磷酸 酯酶
T7 DNA聚合酶经过适当化学处理可以使其 失去3’→5’外切酶活性而转变为一种新的 DNA聚合酶一一修饰的T7 DNA聚合酶。修饰的 T7 DNA聚合酶由于失去了核酸外切酶活性，在 单链模板上的聚合作用的速率增加了3倍，在 物理特性、聚合酶性质以及连续合成能力等方 面，都同天然的T7 DNA聚合酶完全一样。修饰 的T7 DNA聚合酶是双脱氧终止法对长片段DNA 进行序列测定的理想用酶，并以测序酶作为商 品名广泛使用。此外，修饰的T7 DNA聚合酶也 可用于有效地填补和标记具有5’突出未端的 DNA片段之3’末端。
3 分 子
机 理
１酶与ATP （或NAD＋）生成 一种共价结合的酶－AMP复合 物,ATP（或NAD＋）提供了激 活的AMP
3
分
子 机
理
2 激活的AMP转移到DNA一条链的5’ －末端磷酸基团上，形成DNA－腺 苷酸复合物。 3 3’－OH对活跃的磷原子作亲核 攻击，形成磷酸二酯链，同时释放 出AMP。
1、底物和激活剂
DNA聚合酶Ⅰ催化聚合反应需要四种三磷酸 脱 氧 核 苷 dNTP（dATR dGTP、dCTP、dTTP） 作 为 底物，同时需要Mg2+ 激活。其他的核苷酸如一磷 酸脱氧核苷或二磷酸脱氧核苷都不能作为DNA聚 合酶Ⅰ催化的聚合作用的底物。另外，Mg2+ 是该 酶不可缺少的激活剂。
2、带有3’-端游离羟基的引物链 DNA聚合酶Ⅰ需将脱氧核苷酸加 到DNA引物链的3’-OH末端，使链延 长，其聚合作用总是在生长链的3’OH末端基团与搀入进来的核苷酸之间 发生的。当这个核苷酸搀人之后，它 又提供另一个游离的末端基团。因此 DNA聚合酶Ⅰ催化的DNA链的合成总是 按5’→3’方向延长。
4、T7 DNA聚合酶
T7 DNA聚合酶是从感染了T7噬菌体的大肠杆 菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核 酸酶，由两种不同的亚基组成：一种是T7噬 菌体基因5编码的蛋白质，其分子量为84kD；
另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白
（thioredoxin），其分子量为12kD。
T7 DNA聚合酶具有极高的连续合成能力（即高度
5 平末 端 DNA 片段 的连 接
T4DNA连接酶的连接 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头（adapter）连接法

同聚物加尾法
1原理
同 聚 物 加 尾 法
需要末端脱氧核苷酸转移酶， 能够将核苷酸加到DNA分子单链延 伸末端的3’－OH上，并不需要由 模板的存在，当反应物中只存在 一种脱氧核苷酸的条件下，便能 够构成由同一种类型的核苷酸组 成的尾巴。
2 衔可 接设 物计 ，具 并不 可同 大限 量制 制酶 备识 。别 位 点 的
1 兼 具 同 聚 物 加 尾 和 黏 性 末 端 的 优 点

优 点
DNA接头（adapter）连接法
人工合成的一头具某种限制性内 切酶粘性末端，另一头为平末端 的特殊双链寡核苷酸短片段。 当它的平末端与平末端的外源DNA 片段连接之后，便是后者成为具 粘性末端的新的DNA分子。
第二章 酶学基础
第二节连接酶

第二 节
连接 酶



1 概念 2 特性 3 分子机理 4 粘性末端的连接 ５平末端的连接 ６影响因素
1
连接酶：能够催化在两条DNA链
概 念
之间形成磷酸二酯键的酶
nick
gap
连接酶
有活性
连接酶
无活性
（a）
（b）
（a）具有3’－OH和5’－P基团的一个缺 口，失去磷酸二酯键，连接酶可封闭起来。 （b）缺失一个或数个核苷酸的裂口， 连接 酶不能将它封闭起来。
2 程序 3 缺点
程序
1 在平末端的DNA分子上产生出带3’ －OH的单链延伸末端
2 连接反应 由核酸外切酶处理的DNA、 DNTP、末端脱氧核苷酸转移酶组成。
3 DNA分子的3’－OH将会出现单纯由 某一核苷酸组成的单链延伸的尾巴。 按同样道理给另一DNA分子加上互补 的尾巴 4 2个互补末端的DNA分子实现了连接
3、DNA模板
DNA聚合酶Ⅰ催化聚合反应需 要模板链。模板可以是单链，也可 以是双链。双链的DNA只有在其糖磷酸主链上有一至数个断裂的情况 下，才能成为有效的模板。
DNA聚合酶Ⅰ除了具有5’→3’方向的聚合活 性以外，还有两种外切活性。 5’→3’方向的外切活性可以从DNA链的5’ 末端水解DNA分子。这种水解作用的主要产物 是5’磷酸核苷，但同时也有少量的寡核苷酸 片段。5’→3’外切酶活性可以随着DNA的合 成而增强，而且对DNA双链中的单链缺口（带 5’-磷酸）也有活性。 3’→5’方向的外切活性可以从3’-羟基末 端开始向5’端的方向水解DNA，并释放出单 核苷酸。酶水解反应的底物可以是单链也可 以是双链DNA分子，但对双链DNA，当有dNTP 存在时，这种降解活性会被5’→3’方向的 聚合活性所抑制。
5'- G 3'- CTTAA
32P-dATP
5'- G A*A* 3'- CTTAA
Klenow
5'- GTGA
3'- CACT
32P-dATP
5'- G
3'- CACT
5'- G T*
3'- CACT
Klenow
3、T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大 肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚 合酶。它由噬菌体基因43编码，分子量为 114kD，同大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段 相似，具有两种酶催活性，即5’→3’的聚 合酶活性和3’→5’外切酶活性。而且 3’→5’外切活性对单链DNA的作用比对双链 DNA更强。
1、DNA聚合酶Ⅰ
到目前为止，已经从大肠杆菌中纯 化出三种不同类型的DNA聚合酶，即DNA聚 合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。在 大肠杆菌中，DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅱ被 认为主要参与DNA的修复，而DNA聚合酶Ⅲ 功能则与DNA复制有关。在分子克隆操作 中主要使用的是DNA聚合酶Ⅰ。
DNA聚合酶Ⅰ是由大肠杆菌pol A基因编码的一种 单链多肽，分子量为109kD。它具有三种活性， 即5’→3’聚合活性、5’→3’外切活性和 3’→5’外切活性。要使DNA聚合酶Ⅰ发挥催化 合成DNA互补链的作用，必须具备下述3个条件。
缺点
在重组工作中经常还需要从重 组分子上分离出克隆的DNA片段， 如果重组DNA是T4DNA连接酶或同聚 物加尾法构建的，就无法用原来的 限制酶作特异性的切割，因此就不 能够获得插入的DNA片段。后面两 种方法将克服这种缺陷。
衔接物（linker）连接法
1 用化学方法合成的一段由10－20 个核苷酸组成，具有一个或数个限 制识别位点的平末端的双链寡核苷 酸短片段。