第二章基因工程酶学基础
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第二章 基因工程的酶学基础
Enzymes
第二章基因工程酶学基础
工具酶种类: Restriction endonuclease DNA ligase DNA polymerase DNA prosessing enzyme
第二章基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 一类能够识别双链DNA分子中的某种
第二章基因工程酶学基础
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
杂同交尾位酶点的（粘h性y末br端id 互si相te）结：合同后尾形酶成切的割新位 点DN一A般产(不生能的o末r 端能连？接)再后被所原形来成的的酶新识的别位。点。 Ba焊m死H ：I 同53’’尾--GC酶CT产A生G 的粘性G末A端T连CAT接--35后’’ ，B不gl能Ⅱ
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。酶切 后产生不同的DNA末端。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
第二章基因工程酶学基础
（4）同尾酶(Isocaudamer）
来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
3’-
GACGTC
5’-
CTGCA
G
3’-
G
ACGTC
-3’ -5’
-3’ -5’
第二章基因工程酶学基础
（2）粘性末端的意义 连接便利
✓不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
✓同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接 成环形分子。
λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ 12 ）个
切割位点？
➢理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为
（ 1/4n ）。
第二章基因工程酶学基础
（6）II型限制性内切酶酶解反应的条件
➢大部分需要相似的反应条件
Tris-HCl 50mM pH7.5
MgCl2 10mM
0-50mM 低盐酶
NaCl 0-150mM 50-100mM 中盐酶
➢ 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列
（多数是回文序列--palindrome）。
➢识别位点严格专一，识别位点或两侧处切割。
➢形成sticky end或blunt end
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
第二章基因工程酶学基础
2. III类限制性内切酶
识别位点严格专一（不是回文结构），但切
点不专一，往往不在识别位点内部。反应需
要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）,数量
较少。
24-26bp
EcoP1: AGACC
EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
第二章基因工程酶学基础
3. II类限制性内切酶
DTT（二硫苏糖醇 ）1mM 100-150mM高盐酶
Volume 20-100ul
T
37℃
>1 hr
一部分为 50-65℃ ，少数 25-30℃
第二章基因工程酶学基础
三、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、乙醇、SDS、EDTA 等都会影响酶的活性。
①纯化DNA ②加大酶的用量 1ugDNA用10U酶 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
的DNA片段具有相同的粘性末端。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-TCTAGA-5’
5’-TGATCA-3’ Bcl I 3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’ Xho Ⅱ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
产生粘性末端
产生平齐末端
第二章基因工程酶学基础
（1）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G AATTC
-3’
3’-
CTTAA G
-5’
第二章基因工程酶学基础
特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关 位置切割DNA双链的核酸内切酶。
第二章基因工程酶学基础
二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
第二章基因工程酶学基础
1. I型限制性内切酶 M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆 菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
第二章基因工程酶学基础
（2）切割位点
距离特异性识别位点约400-7000bp，切割序 列没有专一性。
Recognize site
cut
400-7000bp （3）作用机理
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
第二章基因工程酶学基础
（3）同裂酶（Isoschizomers) 异源同工酶:来源不同，但具有相同的识 别序列的限制性内切酶。
① 完全同裂酶： 识别序列和切点完全相同。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
第二章基因工程酶学基础
用任何一种酶酶切。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
hybrid site Sau 3A
第二章基因工程酶学基础
Bgl Ⅱ
（5）识别位点在DNA分子中的频率
假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸 有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷 酸有一个识别序列。
第二章基因工程酶学基础
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶：
dcm甲基化酶
wk.baidu.com
GATC：AN6--CH3 CCA/TGG：C5--CH3
影响酶：BamH I等 影响酶：EcoRII等
➢基因工程中必须使用甲基化酶失活
突变的菌株。
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3. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求25-30oC或50-65 oC
Enzymes
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工具酶种类: Restriction endonuclease DNA ligase DNA polymerase DNA prosessing enzyme
第二章基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 一类能够识别双链DNA分子中的某种
第二章基因工程酶学基础
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
杂同交尾位酶点的（粘h性y末br端id 互si相te）结：合同后尾形酶成切的割新位 点DN一A般产(不生能的o末r 端能连？接)再后被所原形来成的的酶新识的别位。点。 Ba焊m死H ：I 同53’’尾--GC酶CT产A生G 的粘性G末A端T连CAT接--35后’’ ，B不gl能Ⅱ
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。酶切 后产生不同的DNA末端。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
第二章基因工程酶学基础
（4）同尾酶(Isocaudamer）
来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
3’-
GACGTC
5’-
CTGCA
G
3’-
G
ACGTC
-3’ -5’
-3’ -5’
第二章基因工程酶学基础
（2）粘性末端的意义 连接便利
✓不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
✓同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接 成环形分子。
λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ 12 ）个
切割位点？
➢理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为
（ 1/4n ）。
第二章基因工程酶学基础
（6）II型限制性内切酶酶解反应的条件
➢大部分需要相似的反应条件
Tris-HCl 50mM pH7.5
MgCl2 10mM
0-50mM 低盐酶
NaCl 0-150mM 50-100mM 中盐酶
➢ 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列
（多数是回文序列--palindrome）。
➢识别位点严格专一，识别位点或两侧处切割。
➢形成sticky end或blunt end
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
第二章基因工程酶学基础
2. III类限制性内切酶
识别位点严格专一（不是回文结构），但切
点不专一，往往不在识别位点内部。反应需
要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）,数量
较少。
24-26bp
EcoP1: AGACC
EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
第二章基因工程酶学基础
3. II类限制性内切酶
DTT（二硫苏糖醇 ）1mM 100-150mM高盐酶
Volume 20-100ul
T
37℃
>1 hr
一部分为 50-65℃ ，少数 25-30℃
第二章基因工程酶学基础
三、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、乙醇、SDS、EDTA 等都会影响酶的活性。
①纯化DNA ②加大酶的用量 1ugDNA用10U酶 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
的DNA片段具有相同的粘性末端。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-TCTAGA-5’
5’-TGATCA-3’ Bcl I 3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’ Xho Ⅱ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
产生粘性末端
产生平齐末端
第二章基因工程酶学基础
（1）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G AATTC
-3’
3’-
CTTAA G
-5’
第二章基因工程酶学基础
特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关 位置切割DNA双链的核酸内切酶。
第二章基因工程酶学基础
二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
第二章基因工程酶学基础
1. I型限制性内切酶 M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆 菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
第二章基因工程酶学基础
（2）切割位点
距离特异性识别位点约400-7000bp，切割序 列没有专一性。
Recognize site
cut
400-7000bp （3）作用机理
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
第二章基因工程酶学基础
（3）同裂酶（Isoschizomers) 异源同工酶:来源不同，但具有相同的识 别序列的限制性内切酶。
① 完全同裂酶： 识别序列和切点完全相同。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
第二章基因工程酶学基础
用任何一种酶酶切。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
hybrid site Sau 3A
第二章基因工程酶学基础
Bgl Ⅱ
（5）识别位点在DNA分子中的频率
假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸 有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷 酸有一个识别序列。
第二章基因工程酶学基础
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶：
dcm甲基化酶
wk.baidu.com
GATC：AN6--CH3 CCA/TGG：C5--CH3
影响酶：BamH I等 影响酶：EcoRII等
➢基因工程中必须使用甲基化酶失活
突变的菌株。
第二章基因工程酶学基础
3. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求25-30oC或50-65 oC