第2章基因工程的酶学基础

（1）在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。 靠近5’ 端切割产生 5' 端突出的粘性末端，如 EcoRI ：
5' …G▼AATT C…3' 3' …C TTAA▲G…5' EcoR I 5’AATTC…3' 5' …G 3' …CTTAA 5’ G… 5'
（2）靠近 3' 端切割产生3' 端突出的粘性 末端。如Pst I：
如果DNA纯度不高时，可采取以下措施：
增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应 时间、添加阳离子亚精胺等。
3.DNA的甲基化程度 识别序列中特定核苷酸的甲基化会影响酶 的活性。 在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大 肠杆菌菌株制备质粒DNA。 可根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化 敏感性研究真核基因组DNA的甲基化作用 模式。例如，MspI可以切割甲基化的 CCGG，而HpaII不能切割甲基化的序列。
2. 限制酶HindIII的发现
Smith 等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindIII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的 限制酶谱。
二、限制性内切核酸酶的类型
已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种 不同类型： Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在 识别位点附近的核苷酸切割DNA双链，但 切割序列是随即的，无专一性。在基因工 程中应用不大。 Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在 识别序列的固定位置切割双链DNA分子， 是基因工程中最常用的工具酶。
Ⅲ型酶：有专一的识别序列，但不是对称 的回文序列，在识别序列旁边的位置上切 割双链。切割后产生的DNA片段具有各种 单链末端。
Ⅳ型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。
三、限制性内切酶的命名
命名原则： 属——种——株——分离序号 例如：EcoRⅠ 属：Escherichia 种：coli 株：R 分离序号：Ⅰ
大多数Ⅱ型限制内切酶的识别序列长度为 4~6bp，具有双重旋转对称结构的回文序列 （palindromic sequence）。
BamHⅠ： GGATCC CCTAGG
如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为 中间的一对碱基，如MaeⅢ的识别序列为：
--GTNAC---CANTC-其中，N为任意碱基。
第2章 基因工程的酶学基础
限制性内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶和反转录酶
DNA修饰酶
外切核酸酶
单链内切核酸酶
RNA酶
核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。 根据水解的不同方式，分为：
外切核酸酶（exonuclease） 内切核酸酶（endonuclease）
5' …C TGCA▼G…3' 3' …G▲ACGT C…5' Pst I 5' …CTGCA3’ G…3' 3' …G 3’ACGTC… 5'
（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平 末端或称钝性末端（blunt end），如SmaI：
5' …CCC▼GGG…3' 3' …GGG▲CCC…5' Sma I 5' …CCC 3' …GGG GGG…3' CCC… 5'
分为两类： 依赖于DNA的DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶-反转录酶
一、DNA聚合酶
Ⅰ. E.coli DNA聚合酶I（polI）-Kornberg酶
1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白 酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中 小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切 酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板 DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性：具3’→5’和5’→3’外切酶活性
DNA聚合酶Ⅰ的
重要用途是用于缺
口平移法制备核酸
的杂交探针。
Ⅱ. Klenow片段 Klenow片段具有DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性 和3’-5’外切酶活性 ① 补平 3’ 凹端 DNA 。使用单纯的 DNA 合成活性。注意要加足够的 dNTP ；如果 使用带标记的 dNTP ，则可对 DNA 进行 末端标记。
三、DNA连接酶（ligase）的作用机理
四、影响连接反应的因素
1.反应温度： 黏性末端：4~15℃比较合适 平末端：10~20℃ 2.连接酶浓度： 平末端连接所需酶量较多 黏性末端连接所需酶量较少。
3.ATP浓度
一般情况下ATP最适的终浓度为0.5mmol/L。
依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
依赖ATP的DNA连接酶 依赖NAD+的DNA连接酶
依据其来源可分为三类：
T4噬菌体DNA连接酶、 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定DNA连接酶。
二、DNA连接酶的特点
连接反应需要一条DNA链游离的3’-OH，另 一条链5’末端具有磷酸基团。 连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅因 子和激活因子。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA 分子！ DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的 缺口（nick），不能封闭失去核苷酸所形成 的裂口（gap）
根据作用的核酸底物不同，分为：
RNA酶 DNA酶 底物非专一性核酸酶
2.1 限制性内切酶
定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异 序列, 并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶。
一、限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现
有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或 二位碱基并非严格专一，但不影响其作用位 点，只是增加酶的识别和作用频率。如 HindⅡ识别序列为--GTYRAC--，其中Y表 示C或T，R表示A或G。 有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀 有限制性内切酶，如NotⅠ，识别序列为 （GCGGCCGC）
5.DNA分子的构型 某些限制酶，切割超螺旋的质粒DNA或病 毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA 的高出许多倍。 还有些限制性核酸内切酶切割它们自己的 处于不同部位的限制位点，其效率也有明 显的差别。 大多数内切酶对只含识别序列的寡聚核苷 酸不具有催化活性。
HindIII
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
2.同切点酶（或同裂酶，isoschizomer）
同裂酶：是一类来源于不同的微生物、能 识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。
识别序列相同，切割位点不同
例：SmaⅠ CCC ↓ GGG XmaⅠ C ↓ CCGGG 识别序列相同，切割位点也相同 例：HpaⅡ与MspⅠ识别顺序都是C↓CGG
3.同尾酶（isocaudamer） 定义：来源不同，识别的靶序列也各不相 同，但切割后能产生相同的黏性末端。
六、限制内切核酸酶对DNA的消化作用
1.DNA分子的双酶切消化
可以先后分别在不同的反应体系中进行：
先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节 盐离子浓度，加入另一种酶切割。 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后 再加入第二种酶。
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
完全酶切消化：内切酶对DNA序列中全部 的识别序列进行切割。 部位酶切：内切酶对DNA序列中所有的识 别序列进行不完全切割。
20世纪60年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。
从天然宿主大肠杆菌K中分离得到的λk噬菌体， 当其感染B菌株时，感染率仅为10-4，分离得到幸 存的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率为 100%；若再用其感染K菌株，感染率又降为10-4。
此现象称为宿主限制现象。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割双 链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源 DNA在自身细胞内的存在。 几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基 化相同DNA位点的甲基转移酶共同作用， 构成限制-修饰系统。 宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保 护起来，不被限制性内切酶识别，从而使 自身DNA免受降解。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
Байду номын сангаас
GATCT A + A TCTAG
五、影响限制内切核酸酶活性的因素
1.酶的纯度
2.DNA样品的纯度
高纯度DNA是必需的
样品如果残留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、 SDS等物质，或蛋白质、多糖等都可能影响 内切酶的反应活性。
2hr 20hr 0 0 0 0 10% 75% >90 >90
EcoRI
GGAATTCC
6.反应缓冲液
pH范围： 7.0~7.6
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、二硫苏糖醇（DTT）或β巯基乙醇 有些酶需要BSA，以防止酶在低浓度蛋白 质溶液中变性。
7.酶的星号活性（star activity） 当条件改变时，许多酶的识别位点会改变， 导致识别与切割序列的非特异性，称为星号 活性。 EcoRⅠ正常情况下，其靶子序列为GAATTC， 但若缓冲液pH>8、盐离子浓度低于50mm和 甘油超过5%（V/V），可在NAATTN处切割， 以EcoRI*表示
当ATP浓度上升至5.0mmol/L时，将影响酶
对平末端的连接；
当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
4.DNA片段末端
2.3 DNA聚合酶和反转录酶
DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物 和模板的存在下，把dNTP连续加到DNA分 子3-OH末端，催化核苷酸的聚合。
4.酶切反应的温度
大多数限制性内切酶的最适反应温度为37℃。
表2-3 部分限制性内切酶的最适反应温度 酶 ApaI ApyI BanI BclI BstEII 反应温度 30℃ 30℃ 50℃ 50℃ 60℃ 酶 MaeI MaeII MaeIII SmaI TaqI 反应温度 45℃ 50℃ 55℃ 25℃ 65℃
（二）切割位点的特异性 1.DNA分子酶切片段的末端 切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产 生的DNA片段5’端为磷酸基，3’ 端为羟基。
酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末 端等形式。 黏性末端：DNA分子在限制性内切酶的作 用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成 的末端结构。它们能够通过互补碱基间的 配对而重新连接起来。
8.限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品 前往往需要钝化内切酶的活性。 钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温 浴5分钟。 但有些酶，如BamH I和HaeⅡ具备对热稳 定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol／ L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到 10mmol/L 以螯合Mg2+）。
①5’-3’聚合酶活性
条件 :
• Mg2+
•dNTP • 3’-OH
②3’- 5’外切酶活性
沿3’ 5方向识别和切除不配对的DNA生长 链末端的核苷酸。 在体内DNA复制时起校对作用，保证了 DNA复制的真实性，从而降低突变率。
③5’ - 3’外切酶活性
可降解DNA：RNA杂合体中的RNA分子 带切除的核酸分子必须具有5’端游离的磷酸 基团； 核酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋 区段上； 被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱 氧核苷酸
命名 HindⅢ
属 种 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
四、Ⅱ型限制内切酶核酸酶的基本特性
（一）识别序列的特异性
酶切反应注意事项 价格昂贵 决不能用水稀释,以免变性失活。 预先加入除酶以外的所有其他试剂。 取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。 使用无菌的新吸头。 少加水,使体积最小,• 保证酶液体积不超过总 但 体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。
2.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链 DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸 基因末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连 接在一起。—―分子黏合剂”