基因工程的酶学基础(2)

Recognize site
cut
（3）辅助因子
1-1.5kb
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）
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I型酶：限制修饰系统酶
• 异源多聚体，R、M、S分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点 识别的活性。
• 识别序列全甲基化-不识别 • 识别序列半甲基化-甲基化作用 • 识别序列未甲基化-限制性内切酶作用 • 识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定 • ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）
2 基因工程的酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 核酸外切酶
第六节 单链核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
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1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K 株分离的。
如 EcoB EcoK
（1） 识别序列
未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
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（2）切割位点
在距离特异性识别序列上游约1000—1500 bp处随机切开一 条单链，两条链上的切点相距70~75bp，即末端为单链。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
6. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制 性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
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• 限制性核酸内切酶
• 限制性核酸内切酶的命名
• 属名
种名
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1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
3. 功能 自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
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（1）限制（Restriction
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解， 切成小片断。
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4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
如 Hind ：d菌株 EcoR ：抗药性R质粒
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5. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统， 用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。
• EcoR I的切割位点
• EcoR I的识别序列
• 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ • 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
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• EcoRI等产生的5’-粘性末端
• 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ • 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
（2）修饰（Modification）
细菌自身DNA的碱基被甲基化酶甲基化(修饰) ，不能被 自身的限制性内切酶识别切割而保护。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)
GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基
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（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsdHale Waihona Puke BaiduR: 编码限制性内切酶
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
• EcoRI 37 ℃
• 5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
• 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
• 退火 4-7 ℃
• 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ • 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
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二、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原 则如下：
1. 用属名的第一个字母大写 2. 种名的前两个字母小写 3. 由3个字母形成的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基
本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
株名
• Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
• H i n d III H i n d III
• 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
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三、限制性内切酶的类型
目前已发现600多种限制性内切酶，分为三类。 限制性核酸内切酶的分类分类依据 1）依据识别序列与切割位点是否一致 2）所需辅助因子 分为三类：I型酶、II型酶、III型酶
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稀有切割限制酶（rare cutter） 可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切 酶。
如Not I （GCGGCCGC）
某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个 碱基并非严格专一。
如Hind Ⅱ可识别4种核苷酸序列：
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GTYRAC
-3’
’ Y: C或T
R: A 或G
-
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2. Ⅲ型限制性内切酶
识别序列与切割位点不相一致 切割位点相对固定 反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。
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2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割（一致） 序列呈典型的旋转对称型回文结构