基因工程酶学基础
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2基因工程的酶学基础
GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI
第二章基因工程的酶学基础
P OH
经同尾酶消化的DNA末端连接示意图
BamH I 5' XXXXGGATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAGGXXXXXX 5'
Bgl II 5' XXXXAGATCTXXXXXX 3' 3' XXXXTCTAGAXXXXXX 5'
5' XXXXG GATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAG GXXXXXX 5'
限制性核酸内切酶的分类
I型
II 型
III 型
1. 限制修饰活性 单一多功能的酶 限制酶和修饰酶分开 双功能酶
2. 内切酶的蛋白 3种不同亚基
单一成分
2种亚基
质结构
3. 限制辅助因子 ATP、Mg2+和S- Mg2+ 腺苷甲硫氨酸
ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸
4. 切割位点
5. 特异性切割 6. 基因克隆中
距特异性位点 1000bp 不是
无用
特异性位点及其附近 特异性位点3‘端 24-26bp处
是
是
非常有用
有用
限制性核酸内切酶的命名
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
4×10 — 4 1
大肠杆菌B
10 — 4
大肠杆菌K
1 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象
经同尾酶消化的DNA末端连接示意图
BamH I 5' XXXXGGATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAGGXXXXXX 5'
Bgl II 5' XXXXAGATCTXXXXXX 3' 3' XXXXTCTAGAXXXXXX 5'
5' XXXXG GATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAG GXXXXXX 5'
限制性核酸内切酶的分类
I型
II 型
III 型
1. 限制修饰活性 单一多功能的酶 限制酶和修饰酶分开 双功能酶
2. 内切酶的蛋白 3种不同亚基
单一成分
2种亚基
质结构
3. 限制辅助因子 ATP、Mg2+和S- Mg2+ 腺苷甲硫氨酸
ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸
4. 切割位点
5. 特异性切割 6. 基因克隆中
距特异性位点 1000bp 不是
无用
特异性位点及其附近 特异性位点3‘端 24-26bp处
是
是
非常有用
有用
限制性核酸内切酶的命名
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
4×10 — 4 1
大肠杆菌B
10 — 4
大肠杆菌K
1 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象
第二章 基因工程的酶学基础
Mg2+
ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸
特异性位点及其附近 特异性位点3‘端 24-26bp处 是 是 非常有用 有用
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名
Haemophilus influenzae d
嗜血流感杆菌d株
H i n d III
H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
3、DNA连接的策略
粘性末端DNA片段的连接
Nick
Nick
平末端DNA片段的末端加尾连接法
5’ 3’ 5’ 3’
3’
+dATP
5’
末端核苷酸转移酶
3’
+dTTP
5’
5’
5’ AAAAA 3’
5’ DNA聚合酶和 T4DNA连接酶 TTTT 3’
3’
3’
5’
平末端DNA片段加接头连接法
衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段1012个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。 使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使 之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性 末端的DNA片段。
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形 成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很 容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。 平 末 端 Blunt end 因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐 的末端结构，这种末端不易重新连接起来。 同裂酶 同尾酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
第三章 基因工程的酶学基础
第三章基因工程的酶学基础第三章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease）一、限制性核酸内切酶的发现早在五十年代初，两个研究小组几乎同时发现了两种不同来源的l噬菌体（lK和lB）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞（K株和B株），但当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，则感染频率普遍下降数千倍。
一旦lK噬菌体在B 株中感染成功，由B株繁殖出的lK后代在第二轮接种中便能象lB一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。
这种现象称为宿主细胞的限制和修饰作用，它广泛存在于原核细菌中。
1960s，Linn和Arber在研究细胞限制性和修饰现象时在大肠杆菌中发现了限制性内切酶，人们才搞清了细菌限制和修饰作用的分子机制。
大肠杆菌K株和B株都含有各自不同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制，其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断；hsdM的编码产物是DNA甲基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；而hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。
lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA 和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。
当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。
此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。
大肠杆菌C株不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K 株和B株中受到严格的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。
基因工程 第二章 基因工程的酶学基础
Sau3A I
GATC CTAG SauI G TCGAC CAGCTG
BamH I
GGATCC CCTAGG Xho I CTCGAG GAGCT C GTCGAG
?
CAGCTC
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端);
同时，同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互 补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中有一定的作用;
（三）DNA的甲基化程度 原核生物细胞内存在限制-修饰系统，其中MTase 甲基转移酶对DNA起修饰作用，从而使自身DNA不 受体内限制性内切核酸酶的切割 甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 为了克服MTase甲基转移酶的影响，在基因克隆 中使用MTase缺失的菌株来制备质粒DNA。
普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提议的 命名系统 由属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字 母（小写），组成3个字母的略语组成酶的基本 名称。
例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示， 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2 3 酶的纯度 DNA样品的纯度 DNA的甲基化程度
5
6 3 7
DNA分子的构型 反应缓冲液 酶的星号活性
4
酶切反应的温度
（一）酶的纯度 高质量的限制性内切核酸酶应是通过全面 提纯的，不存在其他内切核酸酶或外切酶的 污染
在长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降 酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等。
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
• 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个 字母。
Escherichia coli RI — EcoRI Haemophilus influensae d Ⅲ— HindⅢ Streptomyces achromagenes I （Ⅱ) — SacI (II)
GATC CTAG SauI G TCGAC CAGCTG
BamH I
GGATCC CCTAGG Xho I CTCGAG GAGCT C GTCGAG
?
CAGCTC
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端);
同时，同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互 补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中有一定的作用;
（三）DNA的甲基化程度 原核生物细胞内存在限制-修饰系统，其中MTase 甲基转移酶对DNA起修饰作用，从而使自身DNA不 受体内限制性内切核酸酶的切割 甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 为了克服MTase甲基转移酶的影响，在基因克隆 中使用MTase缺失的菌株来制备质粒DNA。
普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提议的 命名系统 由属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字 母（小写），组成3个字母的略语组成酶的基本 名称。
例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示， 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2 3 酶的纯度 DNA样品的纯度 DNA的甲基化程度
5
6 3 7
DNA分子的构型 反应缓冲液 酶的星号活性
4
酶切反应的温度
（一）酶的纯度 高质量的限制性内切核酸酶应是通过全面 提纯的，不存在其他内切核酸酶或外切酶的 污染
在长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降 酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等。
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
• 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个 字母。
Escherichia coli RI — EcoRI Haemophilus influensae d Ⅲ— HindⅢ Streptomyces achromagenes I （Ⅱ) — SacI (II)
第三章基因工程的酶学基础
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或 5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影 响的酶有EcoR II等
哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引 入甲基
（3）核酸内切酶的缓冲液性质
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极 端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序 列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。
6.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件
Tris--HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl
0 -150 mM
DTT
1 mM
Volume 20 - 100 μl
T 37 ℃ 1- 1.5 h
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
识别序列 切割位点距
TGAN8TGCT AACN6GTGC
距识别序列1kb 处随机性切割
旋转对称序列
识别序列内或附近 特异性切割
GAGCC
CAGCAG
识别序列下游24-26bp处
3.限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母： 大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母： 大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字： 表示该菌株发现的限制酶的编号
4．同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点 的选择余地更大。
杂种位点（hybrid site）由一对同尾酶分别产生的 粘性末端共价结合形成的位点。
一不能被原来的任何一种同尾酶识别。
哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引 入甲基
（3）核酸内切酶的缓冲液性质
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极 端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序 列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。
6.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件
Tris--HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl
0 -150 mM
DTT
1 mM
Volume 20 - 100 μl
T 37 ℃ 1- 1.5 h
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
识别序列 切割位点距
TGAN8TGCT AACN6GTGC
距识别序列1kb 处随机性切割
旋转对称序列
识别序列内或附近 特异性切割
GAGCC
CAGCAG
识别序列下游24-26bp处
3.限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母： 大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母： 大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字： 表示该菌株发现的限制酶的编号
4．同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点 的选择余地更大。
杂种位点（hybrid site）由一对同尾酶分别产生的 粘性末端共价结合形成的位点。
一不能被原来的任何一种同尾酶识别。
基因工程的酶学基础
5′···GTNAC···3′ 3′···CANTG···5′
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。
基因工程的酶学基础
是带3’-OH的RNA或DNA 短链；
RNaseH活性： 5 ´ →3 ´ 或3 ´ →5 ´ 方向特异地降解
RNA-DNA杂交分子中的RNA链。
已从多种RNA肿瘤病毒中分离到反转录酶，商品
化酶有来源于禽骨髓母细胞瘤病毒（AMV)和鼠白
血病病毒(M-MLV)的逆转录酶。二者在RNaseH活 性、最适反应温度及pH等有差异。
3.4 核酸修饰酶
除前述的一些酶外，还使用一些修饰酶对
核酸分子进行修饰，如用末端转移酶进行
同聚物加尾，用碱性磷酸酶切除DNA5’端
磷酸基团，防止载体自身环化等。
3.4.1 末端（脱氧核苷酸）转移酶
从小牛胸腺中纯化，能够催化 dNTP进行
5′→ 3′方向的聚合作用，逐个将脱氧核苷酸
分子加到线性DNA分子的3′-OH末端。主
1、DNA接头连接法
接头是人工合成包含某一限制酶切位点的短寡核苷酸， 本身已是粘性末端。
2、衔（连）接物连接法
衔（连）接物是人工合成包含 某一限制酶切位点的短寡双链 核苷酸。
3、同聚物加尾法
利用末端转移 酶，在平端 DNA分子的3´ 端加一串相同 核苷酸组成的 粘性末端。
3.3 DNA聚合酶
反应条件：
低水平Zn2+、最适pH值4.0~4.3、NaCl浓度 100mmol/L
要的应用是同聚物加尾。
不需模板，但底物至少是3个核苷酸以上的
片段，底物单链双链都可以。
例：用同 聚物加尾 法再生 HindIII识 别位点
3.4.2 T4多核苷酸激酶与DNA分子5′-末端标记
T4噬菌体基因编码，正向反应催化γ-磷酸从ATP 分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端。反应 不受底物分子链长短的限制。哺乳动物细胞也有 这种激酶。
基因工程的酶学基础课件
第六章 基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
30
六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
32
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
35
6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
45
6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
30
六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
32
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
35
6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
45
6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
第二章基因工程的酶学基础
第二章基因工程的酶学基础内容一、概述二、限制性内切核酸酶三、DNA连接酶四、其他工具酶一、概述工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
工具酶名称主要功能限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5’-OH末端上(接下表格)工具酶名称主要功能反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团BAP orCIAP核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链工具酶名称主要功能核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase二、限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶的分类2、限制性核酸内切酶的命名原则3、限制性核酸内切酶的基本特征4、影响限制性内切酶的活性因素5、限制性核酸内切酶的应用1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶主要分成三大类：I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。
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第二章 基因工程的酶学基础
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
限制性内切酶 DNA DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶
基因工程酶学基础
基本概念及其生物功能
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。 限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
基因工程酶学基础
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内 切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割 特性、催化条件及是否具有修饰酶活性， 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
• 根据作用的核酸底物不同:
特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
• 按水解断裂核酸分子的方式:
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶
从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内
切核酸酶
3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存基在因工防程酶御学基础外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
EOP=1
phage λ (B)
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，
1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护.
2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点---
---（修饰）
基因工程酶学基础
3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 ------（限制）
4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外 来却不被降解。
5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主 菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。
基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。 基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
基因工程酶学基础
限制性核酸内切酶概念
限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)， 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
基因工程酶学基础
1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
EOP=1（修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似 于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
基因工程酶学基础
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。
基因工程酶学基础
限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
基因工程酶学基础
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒
基因工程酶学基础
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
基因工程酶学基础
限制和修饰作用的分子机制
1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和 修饰系统。
限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制。
基因工程酶学基础
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传基因物工程质酶学的基础目的。
基因工程酶学基础
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
基因工程酶学基础
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的 操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
限制性内切酶 DNA DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶
基因工程酶学基础
基本概念及其生物功能
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。 限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
基因工程酶学基础
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内 切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割 特性、催化条件及是否具有修饰酶活性， 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
• 根据作用的核酸底物不同:
特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
• 按水解断裂核酸分子的方式:
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶
从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内
切核酸酶
3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存基在因工防程酶御学基础外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
EOP=1
phage λ (B)
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，
1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护.
2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点---
---（修饰）
基因工程酶学基础
3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 ------（限制）
4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外 来却不被降解。
5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主 菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。
基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。 基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
基因工程酶学基础
限制性核酸内切酶概念
限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)， 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
基因工程酶学基础
1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
EOP=1（修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似 于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
基因工程酶学基础
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。
基因工程酶学基础
限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
基因工程酶学基础
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒
基因工程酶学基础
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
基因工程酶学基础
限制和修饰作用的分子机制
1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和 修饰系统。
限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制。
基因工程酶学基础
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传基因物工程质酶学的基础目的。
基因工程酶学基础
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
基因工程酶学基础
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的 操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用