基因工程酶学基础
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第二章 基因工程的酶学基础
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
限制性内切酶 DNA DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶
基因工程酶学基础
基本概念及其生物功能
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。
EOP=1（修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似 于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
基因工程酶学基础
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。 限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
基因工程酶学基础
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
基因工程酶学基础
限制和修饰作用的分子机制
1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和 修饰系统。
• 根据作用的核酸底物不同:
特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
• 按水解断裂核酸分子的方式:
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶
从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内
切核酸酶
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传基因物工程质酶学的基础目的。
基因工程酶学基础
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，
1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护.
2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点---
---（修饰）
基因工程酶学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ础
3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 ------（限制）
4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外 来却不被降解。
基因工程酶学基础
限制性核酸内切酶概念
限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)， 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
基因工程酶学基础
1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
基因工程酶学基础
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的 操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制。
基因工程酶学基础
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存基在因工防程酶御学基础外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
EOP=1
phage λ (B)
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
基因工程酶学基础
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒
基因工程酶学基础
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和 第三个字母。
基因工程酶学基础
限制性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内 切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割 特性、催化条件及是否具有修饰酶活性， 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主 菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。
基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。 基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
基因工程酶学基础
限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
限制性内切酶 DNA DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶
基因工程酶学基础
基本概念及其生物功能
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。
EOP=1（修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似 于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
基因工程酶学基础
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。 限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
基因工程酶学基础
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
基因工程酶学基础
限制和修饰作用的分子机制
1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和 修饰系统。
• 根据作用的核酸底物不同:
特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
• 按水解断裂核酸分子的方式:
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶
从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内
切核酸酶
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传基因物工程质酶学的基础目的。
基因工程酶学基础
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，
1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护.
2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点---
---（修饰）
基因工程酶学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ础
3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 ------（限制）
4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外 来却不被降解。
基因工程酶学基础
限制性核酸内切酶概念
限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)， 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
基因工程酶学基础
1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
基因工程酶学基础
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的 操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制。
基因工程酶学基础
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存基在因工防程酶御学基础外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
EOP=1
phage λ (B)
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
基因工程酶学基础
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒
基因工程酶学基础
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和 第三个字母。
基因工程酶学基础
限制性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内 切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割 特性、催化条件及是否具有修饰酶活性， 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主 菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。
基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。 基因工程酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用
基因工程酶学基础
限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示