酶的固定化

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

1）离子键结合法：
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法
所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。

常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

2）共价键结合法
载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：
（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；
（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等
（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。

用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：
Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。

在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。

载体活化方法：
（1）重氮化法
（2）叠氮法
（3）溴基化法
（4）烷基化法等。

4、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。

常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。

其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。

交联酶法
借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。

可视为一种无载体的固定化方法。

如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。

共交联法
共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。

通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。

如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。

5、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。

只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。

严格控制加热温度和时间。

细胞的固定化方法
利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。

用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。

(2) 包埋法
包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。

凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。

凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。

固定化酶的新方法
1、新型固定化材料的应用
2、（多酶系统）共固定化技术
3、基因工程重组菌的固定化技术
4、定向固定化新技术
新型固定化材料
随着材料科学迅速发展，固定化酶的新材料日益增多；如藻酸铬代替藻酸钙固定化米曲霉β-葡萄糖苷酶，稳定化大为提高；戊二醛硬化后的藻酸盐和明胶；丙烯酸大孔树脂，磁性载体等。

共固定化
共固定化技术已经广泛应用，有酶-酶、酶-辅酶、酶-细胞、细胞-细胞共固定化于同一载体上，例如共包埋于同一凝胶内，参与两步以上的酶催化反应。

基因工程重组菌的固定化技术
重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有很大提高。

在游离重组菌系统中常用抗生素、氨基酸等选择性压力稳定质粒，在大规模生产应用中因费用太高往往难以接受。

采用固定化方法后，这种选择压力可被省去。

定向固定化技术
固定化酶的存在问题：由于酶蛋白可以通过几种氨基酸残基附着在固定化载体上，酶和载体可以产生多点的结合，因固定化酶的位阻障碍而妨碍底物进入酶的活性中心，严重影响酶活力。

近来，已经寻求到几条不同途径，使酶蛋白能够以有序方式附着在载体的表面，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，这样就能有利于底物进入到酶的活性位点里去，而使酶活性的损失降到最小。

酶的定向固定化方法
定向固定化方法主要有：
（1）借助化学方法的位点专一性固定化；
（2）磷蛋白的位点专一性固定化；
（3）糖蛋白的位点专一性固定化；
（4）抗体（免疫球蛋白）的位点专一性固定化；
（5）利用基因工程的位点专一性固定化等等。

这种有序、定向的固定化技术已经应用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究。

第二节固定化酶的特性
一、固定化酶的特性
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
（一）酶的活性
通常低于天然酶（有例外）。

（二）酶的稳定性
固定化后，一般来说酶的热稳定性、贮藏稳定性和使用稳定性普遍增加。

酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。

可能的原因：
固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；
抑制酶的自身降解。

固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。

（三）酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。

多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。

（四）酶的最适pH
将酶固定于多聚阳离子性载体上时，最适pH向酸性一侧移动；将酶固定于多聚阴离子性载体上时，最适pH向碱性一侧移动；
酶催化的产物为酸性时，固定化酶的最适pH将升高；反之产物为碱性时，固定化酶的最适pH将降低。

（五）酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数K m随载体的带电性能变化。

固定化载体与底物电荷相反，促进底物扩散，固定化酶的表观K m值降低。

固定化载体与底物电荷相同，有扩散阻力，固定化酶的表观K m值显著增加。

（六）底物特异性
酶固定化后，由于形成立体障碍，当底物为高分子时，高分子底物难以接近酶分子。

固定化酶对大分子底物作用速度降低。

小分子底物不受影响。

二、固定化酶的酶活力测定
1、常用的酶活测定方法：
振荡测定法
酶柱测定法
连续测定法
2、固定化酶的比活力单位定义
在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。

即：为每克干重固定化酶每分钟转化底物(或生成产物)的μmol量，表示为μmol/(min·mg)。

若是固定化酶膜、酶管、酶板，则可用单位面积的酶活力单位表示，即酶活力单位/cm2。

需注明测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、用于固定化的游离酶含量或蛋白质含量、及用于固定化的游离酶的比活力。

3、固定化酶的评价指标及其测定
主要指标：固定化酶的活力，结合效率或相对活力，半衰期等。

另外，载体活化程度和固定化配基密度等也是固定化常用的考察指标。

酶结合效率、相对活力和活力回收
酶结合效率或相对活力用以表示固定化过程中引起的酶失活，以及影响固定化酶性质诸因素
的综合效应。

酶结合效率= (加入的总酶活力-未结合的酶活力）
÷加入的总酶活力× l00%
相对活力= 固定化酶总活力÷(加入的总酶活力-未
结合的酶活力) ×100%
酶活力回收率= 固定化酶总活力÷用于固定化的总
酶活力× l00%
固定化酶的半衰期t1/2
半衰期是衡量固定化酶稳定性的重要指标，即固定化酶活力下降为初始活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2 表示。

直接测定
通过较短操作时间后酶活力变化，由下式推算：
在没有扩散限制时，固定化酶活力与时间成指数关系：
t1/2=0.693/K d
K d=2.303/t ×Log(Eo/E)
K d：衰减常数；E o：初始酶活；E：t时间后酶活力
t1/2=0.693/2.303×t/log(Eo/E)=0.3009×t/log(Eo/E)
第三节固定化技术的应用
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。

自学
第九章酶的非水相催化
第一节酶非水相催化的研究概况
酶只有在水溶液中才具有催化活性吗?
1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。

开辟了酶工程领域新的研究方向—非水酶学。

促进了生物催化反应的溶剂工程。

已发现有十多种水解酶和氧化还原酶在有机溶剂中具有催化活性。

非水介质：有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质、低共熔混合介质等。

拓展了酶在工业生物转化中的应用，尤其是在不对称合成转化光化学纯度的医药、农药、精细化工、新材料、手性化合物或手性模块物质方面的应用。

1、有机介质中的酶催化
有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。

酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。

2、气相介质中的酶催化
气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。

适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。

干燥状态的脱硫弧菌氢化酶可以活化氢分子，进行反应，而水质子不参于反应。

3、超临界流体介质中的酶催化
用于酶催化反应的超临界流体应具有的特性：
对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；
良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；
超临界压力不能太高，节约压缩动力费用；
超临界流体要容易获得，价格要便宜等
4、离子液介质中的酶催化
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。

酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。

离子液介质种类：p219-220
5、低共熔混合介质
两种或两种以上物质混合后，形成熔点降低的混合物称之为低共熔混合物。

低共熔混合物并非化合物，原则上它可以被机械方法分离为两纯组分。

熔点为179℃的樟脑45g与熔点为42℃的水杨酸苯酯55g混合后，测其熔点仅为6℃。

非水相介质中酶催化的特点
1、可以将加水分解反应转为其逆反应
2、酶的热稳定性高
3、容易回收和反复利用
4、改变酶对底物的专一性
5、提高有机化合物（尤其是非极性底物）的溶解度
6、低沸点溶剂中可容易分离纯化产物
非水相介质中酶催化的特点
7、能抑制依赖于水的某些不利反应和副产物的产生
8、解除或减少某些产物对酶的抑制作用
9、没有微生物的污染
10、非水系统中酶不易脱离吸附表面，易于酶的固定化
有机相反应介质的种类
a.水与水混溶有机溶剂，均匀混合物，单相。

b.水与水不相混溶的有机溶剂，二相系统。

c.酶粉悬浮在有机溶剂
d.酶与载体结合后，悬浮在溶剂中
e.酶溶解在含水的有机溶剂、表面活性剂的微乳液中
f.共价修饰酶溶于有机溶剂。

(1)微水介质体系
是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。

微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。

另外有一部分水分配在有机溶剂中。

酶以冻干粉或固定化酶形式悬浮于有机介质中，在悬浮状态下进行催化反应。

通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。

(2)与水溶性有机溶剂组成的均一体系
是由水和极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。

酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。

由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在该反应体系中进行催化反应的酶较少。

如：辣根过氧化物酶（HRP）
(3)与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系
是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。

游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。

如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。

催化反应通常在两相的界面进行。

一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。

(4)（正）胶束体系
是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。

表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。

反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。

反应在胶束的两相界面中进行。

(5)反胶束体系
在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。

表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。

反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部。

催化反应在两相的界面中进行。

第二节水对有机介质中酶催化反应的影响
一、水与酶的柔性
酶分子有相对刚性和柔性两个部分
根据酶与底物的诱导契合原理，酶活性部分保持一定的柔性是酶表现其催化活性所必需
实验研究表明：有机溶剂对酶的二级结构没有大的影响
酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。

必需水与酶分子的结构和性质有密切关系
溶菌酶分子的水合过程：
0~0.07g/g蛋白质，一个酶分子周围有0~60水分子，蛋白质自由度很小，没有表现出酶活性0.07~0.25g/g蛋白质，一个酶分子周围有60~220水分子，酶活性显现
0.25~0.38g/g蛋白质，一个酶分子周围有220~300水分子，酶活性逐步升高
＞0.25~0.38g/g蛋白质、＞300水分子，酶分子表面完全水合，酶活降低。

二、结合水
生物反应体系中的水分成溶剂水和结合水。

在酶的催化反应过程中，底物分析先从有机相进入酶表面的水相与酶形成底物-酶复合物后再发生反应。

在绝对无水条件下，酶分子表面含有大量带电基团，和极性基团相互作用而形成“锁定”的失活构象，加入适量水分子充当润滑剂会使酶的柔性增大，维持酶的活性构象。

如果有机溶剂取代了溶剂水，不取代结构水，将不会改变酶的活性构象，不会对活性产生很大的影响。

仿水溶剂：甲酰胺、乙二醇等。

三、水活度（Aw）
研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。

水活度用来描述有机溶剂中酶活性与水含量的关系。

水活度（Aw）：体系中水的逸度与纯水逸度之比。

可以用在一定温度和压力下反应体系中水的摩尔分数χw（凯）与水活度系数γw（伽玛）的乘积。

A w= χw ×γw
在低压条件下，水活度A w是气相中水的分压与同温度下纯水的蒸气压的比值
A w=(Y w ×P) / P0 = P w / P0
水活度
最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。

所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。

在给定的有机溶剂中，水活度随水含量的增加而增大；
对于给定的Aw，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂要少
四、水对酶活力选择性的调节
有机相酶促反应中每个酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下，与溶剂的极性无关，而最佳水活度Aw都在0.55左右。

水活度对酶活力的影响程度随着溶剂的不同而不同。

水对酶的立体选择性也有一定的调节作用。

水活度的概念同样适用于固定化酶。

第三节有机溶剂对有机介质中酶催化
的影响
常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。

(1)有机溶剂对酶结构与功能的影响
有些酶在有机溶剂中，其空间结构会受到某些破坏，使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。

当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。

有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力。

(2)有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。

有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。

P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。

极性系数越大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。

研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。

极性系数lg P< 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。

(3)有机溶剂对底物和产物分配的影响
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。

有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。

一般选用2≤lg P≤5的有机溶剂作为有机介质为宜
(4)有机溶剂对酶选择性的影响
有机溶剂中酶的刚性增强，活性中心结构改变，与底物结合的选择性改变；
以此调节酶对底物的选择性，尤其是针对异构体化合物的催化合成。

第四节非水相中酶催化的特性
一、热力学稳定性
二、酶的特异性
1、底物选择性
在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。

不同的有机溶剂具有不同的极性，底物在水和有机溶剂两相中的分配系数不同，导致酶的底物专一性也不一样。

在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应
2、立体选择性
又称为对映体选择性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。

3、位置选择性
酶在有机介质中进行催化时，酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。

4、化学选择性
酶选择性地催化底物分子中不同功能基团中某个基团的反应特性。

另外，具有化学键选择性
5、其他特性
分子记忆：根据分子识别理论，酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象，从而获得与配体类似物结合的能力，这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆。

pH记忆：在有机介质反应中，酶所处的pH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH 值相同。

这种现象称之为pH记忆
酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同第五节有机介质中酶催化反应
的条件及其控制
有机介质中酶可以催化多种反应，主要包括：
合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。

有机介质中酶催化反应的条件和控制
酶的选择
底物的选择和浓度控制
有机溶剂的选择
水含量的控制
温度的控制
pH的控制
用微生物或酶拆分手性化合物
β-阻断剂普萘洛尔的酶法拆分
β-阻断剂是用于治疗高血压和心肌梗死类疾病的一种药物，其典型的结构式为含有仲醇类外消旋体药物，如:普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗心安等。

普萘洛尔(Propranolol，心得安)，是常用的非特异性β-阻滞药，能拮抗肾上腺的作用，预防心律失常或心肌梗塞，作为高血压治疗用药。

国内销售为外消旋混合物，其左旋体的β-受体阻滞作用很强，右旋体则很弱，还有奎尼丁样作用或局麻作用。

S(-)-异构体的活性是R(+）-异构体的100倍以上。

脂肪酶水解
用脂肪酶对外消旋普萘洛尔合成生产的中间体1-氯-3-(1-萘氧)-2-丙醇(简称萘氧氯丙醇)的酯进行水解；
或利用微生物酶对外消旋的萘氧氯丙醇进行立体选择性酯化、酯基转移；
拆分后得到的手性中间体R(-)-氯醇酯或R(-)-氯醇，e.e.值（对映体过量值）可大于95%。

在碱溶液中再与异丙胺反应即能合成S(-)-普萘洛尔。