细胞示踪技术与应用(GFP)
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细胞示踪技术与应用
(green fluorescent protein ,GFP)
李京宝 2011.11.25
1
主要内容
• GFP • GFP的研究历史 • GFP的应用
学习要点
• 基本特性 • 机遇与重视 • 开阔视野
2源自文库
GFP
—— 基本性状
3
简介
• 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称 GFP • 最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其 基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激 发下，会发出绿色荧光。
1955, Nagoya University, laboratory of Prof.Yoshimasa Hirata.
11
Prof.Frank Johnson‘s Lab, Princeton, NJ, 1959
Friday Harbor, 1961.
Aequorea victoria
12
Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). "Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea". J Cell Comp Physiol 59: 223–39
16
马丁· 查尔菲（Martin Chalfie，1947年－），美国科学家 成长于美国芝加哥 1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位 1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。
17
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994), ―Green fluorescent protein as a marker for gene expression,‖ Science 263: 802–805.
18
美国生物化学家 美国国家科学院院士 美国国家医学院院士 美国艺术与科学院院士 圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。
1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。 1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。 1977年-1981年，剑桥大学研究员。
钱永健 Roger Yonchien Tsien （1952年2月1日－）
21
GFP的应用
—— ―看得见”的科学
22
1、骨架和细胞分裂 ； 2、细胞器动力学和泡囊运输 ； 3、发育生物学 ； 4、神经生物学 ； 5、其他应用 ；
23
细胞骨架
actin
拟南芥胚轴微管- GFP
A hairy root of Medicago truncatula expressing a GFP fusion to the microtubule
tublin
24
细胞分裂
GFP-tubulin
25
细胞器动力学和泡囊运输
Treatment of stable HeLa cells expressing EGFP-LC3 with an autophagy-inducing small molecule increases the formation of autophagic vesicles (EGFPpositive punctate structures). Sarkar et al, Nat Chem Biol, 3(6):331-338 (2007).
31
Thanks！
32
水母素aequorin
GFP
13
30–40 bucketfuls of jellyfish each day.
1 mg of AF-350 150 mg of purified aequorin 50,000 jellyfish.
2004
600 rings per hour （ 10 times more than by hand.）
Roger Y. Tsien
下村脩
马丁· 查尔菲
2008年10月8日
钱永健
9
下村脩（1928年8月27日－），有机化学家、海洋生物学家 1928年生于日本京都， 1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位 美国Woods Hole海洋生物学实验室（MBL） 波士顿大学医学院名誉退休教授
10
小海萤（Cypridina hilgendorfii）
26
发育生物学
Long term 4D imaging of Caenorhabditis elegans embryo
27
神经生物学
28
29
构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFP
gfp 电击转化
pMRP9-1
FRD1-GFP FRD1
30
构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFP
FRD1 明视场观察 激发荧光观察
19
20
―……当然，我希望各个国家的年 轻人都能受到激励，但我知道， 中国人对此会尤其感到骄傲”。 “可能因为我是华裔，很多中国 人可能受到很大鼓舞，希望更多 的中国年轻人也投身到基础理论 研究中来。”
“我是在美国出生长大的，我不 是中国科学家……我的得奖有中 国人高兴，如果这样让很多年轻 人对科学发生兴趣，这是很好的 事。”
7
GFP的研究历史
—— 从下村修到钱永健
8
The Nobel Prize in Chemistry 2008
"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
14
1974年，纯化到了这个蛋白， 时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。
同年，荧光共振能量转移(FRET)在生物中发现 “荧光素——GFP ”
1979年，GFP的发色基团确定 酶解法
15
1992年，Douglas Prasher拿到了GFP的基因（Woods Hole海洋研究所） "I'm really happy for them. I was really surprised that particular topic carried that much weight ." ------Douglas Prasher
5
发光机制
• 生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶 状结构中心。
• 六肽组成的发光中心
• 发光团（三肽）Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成 了对羟基苯咪唑啉酮。 • 自身催化环化的结果
• 有氧过程，O2使Tyr66脱氢氧化。
6
特点
• GFP荧光极其稳定；
• 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大； • 灵敏度高,抗光漂白能力强； • 荧光的产生不需要任何外源反应底物。
"(Douglas Prasher's) work was critical and essential for the work we did in our lab. They could've easily given the prize to Douglas and the other two and left me out." ------Martin Chalfie
由水晶水母（Aequorea victoria） 中发现的野生型绿色荧光蛋白， 395nm和475nm分别是最大和次 大的激发波长，它的发射波长的 峰点是在509nm
4
分子结构
• 238aa,单链 ; • 二聚体, β-桶状结构; • 单体：11个β-折叠包围一个α螺旋； • β-桶状结构直径约3nm，高约 4nm，规则的氢键带 ； • 其末端的短α螺旋以及环状结 构一起组成一个单独的致密 结构域 ；
(green fluorescent protein ,GFP)
李京宝 2011.11.25
1
主要内容
• GFP • GFP的研究历史 • GFP的应用
学习要点
• 基本特性 • 机遇与重视 • 开阔视野
2源自文库
GFP
—— 基本性状
3
简介
• 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称 GFP • 最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其 基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激 发下，会发出绿色荧光。
1955, Nagoya University, laboratory of Prof.Yoshimasa Hirata.
11
Prof.Frank Johnson‘s Lab, Princeton, NJ, 1959
Friday Harbor, 1961.
Aequorea victoria
12
Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). "Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea". J Cell Comp Physiol 59: 223–39
16
马丁· 查尔菲（Martin Chalfie，1947年－），美国科学家 成长于美国芝加哥 1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位 1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。
17
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994), ―Green fluorescent protein as a marker for gene expression,‖ Science 263: 802–805.
18
美国生物化学家 美国国家科学院院士 美国国家医学院院士 美国艺术与科学院院士 圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。
1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。 1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。 1977年-1981年，剑桥大学研究员。
钱永健 Roger Yonchien Tsien （1952年2月1日－）
21
GFP的应用
—— ―看得见”的科学
22
1、骨架和细胞分裂 ； 2、细胞器动力学和泡囊运输 ； 3、发育生物学 ； 4、神经生物学 ； 5、其他应用 ；
23
细胞骨架
actin
拟南芥胚轴微管- GFP
A hairy root of Medicago truncatula expressing a GFP fusion to the microtubule
tublin
24
细胞分裂
GFP-tubulin
25
细胞器动力学和泡囊运输
Treatment of stable HeLa cells expressing EGFP-LC3 with an autophagy-inducing small molecule increases the formation of autophagic vesicles (EGFPpositive punctate structures). Sarkar et al, Nat Chem Biol, 3(6):331-338 (2007).
31
Thanks！
32
水母素aequorin
GFP
13
30–40 bucketfuls of jellyfish each day.
1 mg of AF-350 150 mg of purified aequorin 50,000 jellyfish.
2004
600 rings per hour （ 10 times more than by hand.）
Roger Y. Tsien
下村脩
马丁· 查尔菲
2008年10月8日
钱永健
9
下村脩（1928年8月27日－），有机化学家、海洋生物学家 1928年生于日本京都， 1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位 美国Woods Hole海洋生物学实验室（MBL） 波士顿大学医学院名誉退休教授
10
小海萤（Cypridina hilgendorfii）
26
发育生物学
Long term 4D imaging of Caenorhabditis elegans embryo
27
神经生物学
28
29
构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFP
gfp 电击转化
pMRP9-1
FRD1-GFP FRD1
30
构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFP
FRD1 明视场观察 激发荧光观察
19
20
―……当然，我希望各个国家的年 轻人都能受到激励，但我知道， 中国人对此会尤其感到骄傲”。 “可能因为我是华裔，很多中国 人可能受到很大鼓舞，希望更多 的中国年轻人也投身到基础理论 研究中来。”
“我是在美国出生长大的，我不 是中国科学家……我的得奖有中 国人高兴，如果这样让很多年轻 人对科学发生兴趣，这是很好的 事。”
7
GFP的研究历史
—— 从下村修到钱永健
8
The Nobel Prize in Chemistry 2008
"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
14
1974年，纯化到了这个蛋白， 时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。
同年，荧光共振能量转移(FRET)在生物中发现 “荧光素——GFP ”
1979年，GFP的发色基团确定 酶解法
15
1992年，Douglas Prasher拿到了GFP的基因（Woods Hole海洋研究所） "I'm really happy for them. I was really surprised that particular topic carried that much weight ." ------Douglas Prasher
5
发光机制
• 生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶 状结构中心。
• 六肽组成的发光中心
• 发光团（三肽）Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成 了对羟基苯咪唑啉酮。 • 自身催化环化的结果
• 有氧过程，O2使Tyr66脱氢氧化。
6
特点
• GFP荧光极其稳定；
• 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大； • 灵敏度高,抗光漂白能力强； • 荧光的产生不需要任何外源反应底物。
"(Douglas Prasher's) work was critical and essential for the work we did in our lab. They could've easily given the prize to Douglas and the other two and left me out." ------Martin Chalfie
由水晶水母（Aequorea victoria） 中发现的野生型绿色荧光蛋白， 395nm和475nm分别是最大和次 大的激发波长，它的发射波长的 峰点是在509nm
4
分子结构
• 238aa,单链 ; • 二聚体, β-桶状结构; • 单体：11个β-折叠包围一个α螺旋； • β-桶状结构直径约3nm，高约 4nm，规则的氢键带 ； • 其末端的短α螺旋以及环状结 构一起组成一个单独的致密 结构域 ；