第五章 固定化酶和固定化细胞(上)新
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光交联树脂包埋法
2、微囊化法（又称半透膜包埋法)
将各种浓度、体积或数量的酶封闭 在不同构型的半透膜内的包埋方法。 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质 体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要 用于医学治疗，中空纤维主要适于工 业使用 。 直径10～100um，常用的材料是尼 龙膜和纤维素硝酸膜
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制备微囊型固定化酶有下列几种方法：
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物理吸附法是通过氢键、疏水键和π-电子
亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载 体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化 铝、磷酸钙胶、微孔玻璃等无机吸附剂(1mg 蛋白/g吸附剂) ，纤维素、胶原、面筋、淀粉 以及火棉胶等有机吸附剂(50mg蛋白/g吸附 剂左右) 。
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选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。
共价结合法所用载体分三类
天然高分子有机载体（如多糖、蛋白质、 细胞）； 无机物（玻璃、陶瓷）； 合成高聚物（聚酯、聚胺、尼龙）。 活化方式依载体性质不同而各不相同。
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共价键结合法制备固定化酶的“通 式”
首先载体上引进活泼基团
关键
然后活化该活泼基团
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团 形成共价键
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角叉莱胶包埋法：
将一定量的角叉菜胶悬浮在一定体积 的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至 35～50℃，与一定量的酶悬液混合后， 趁热滴到冷却的氯化钾溶液中，或者先 滴到冷的植物油中，成型后再置氯化钾 溶液中，制成球状固定化酶胶粒。
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聚丙烯酰胺包埋
最常用的包埋法，它的机械强度高，并 可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使 酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱 落。先把单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液 中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联 的高聚物网络。
是指通过物理的或化学的手段，将 酶束缚于水不溶的载体，或将酶 在一定空间内呈闭锁状态存在， 它可以连续地进行反应,反应后的 酶可以回收重复使用。
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第二节 酶的固定方法
一、 固定化酶的优缺点 优点： 多次使用，长期使用 可以装塔连续反应 纯化简单，提高产物质量 有利于控制生产过程 应用范围广 酶的稳定性得到改善
Enzyme Engineering 酶工程
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第五章 固定化酶
第一节 第二节 第三节 定方法 第四节 第五节
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概述 酶的固定方法 微生物、植物、动物细胞的固
固定化原生质体和辅酶 固定化酶的性质
第一节 概述
酶催化(游离酶）的缺点： 1.稳定性差：在高温、强酸、强 碱等外界因素下易失活。 2.酶的一次性使用:反应结束后， 酶即使仍有活性，也难以回收，成本 提高，难于连续化生产。 3.产物的分离纯化较困难：酶与 产物混在一起。
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包埋法的优点： 反应条件 温和、很少改变酶结构的固定 化方法。 包埋法的缺点： 只有小分子底物和产物可以通过高聚物网 架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不 适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产 生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使 活力降低。
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（三）共价结合法：
共价结合法是借助共价键将酶的非活 性必需侧链基团和载体的功能基团 进行结合以制备固定酶的方法。 如此得到的固定化酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使用，是目前应用 和报道得最多的一类方法。但共价 偶联反应一般比较激烈，易使酶变 形失效。
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（3）脂质体包埋法，由表面活性剂和卵 磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物 或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小， 而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可 加快底物透过膜的速度。
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生物细胞也可以作为微胶囊
红细胞：在低渗压的溶液中，红 细胞就会膨胀，膜的通透性变高，血 红蛋白从细胞中渗透出去，酶渗透进 细胞 放回等渗溶液中去，膜的通透性 回复到正常状态，酶就包被在细胞中
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共价结合法中的几个影响因素
1、载体的物化性质要求载体亲水，并且
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有一定的机械强度和稳定性，具备在温和 条件下与酶结合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、 中等离子强度和低温的缓冲溶液中进行。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶 的其它功能基团的影响，副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减 少载体的空间位阻对酶活力的影响。
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共价键结合的固定化方法，是载体结合 法中报道最多的方法。归纳起来有二类：
一是将载体有关基团活化，然后与酶 有关基团发生偶联反应。 另一种是在载体上接上一个双功能试 剂，然后将酶偶联上去。
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可与载体共价结合的酶的功能团有： 或氨基、、或-羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨 基酸残基不应是酶催化活性所必需的， 否则往往造成固定后的酶活性完全丧 失。
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(一)吸附法
•吸附法是最简单的固定化技术，在经济
上也最具有吸引力，只需将酶液与具有 活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。
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吸附法是通过载体表面和酶分子表 面间的次级键相互作用而达到固定目 的的方法。
根据吸附剂的特点又分为两种： 物理吸附(physical adsorption) 离子交换吸附(ion binding)。
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4.1973年，固定化大肠杆菌菌体中的 天冬氨酸酶，生产L-天冬氨酸
5.1976年，法国首次用固定化酵母细 胞生产啤酒和酒精
6.1982年，日本首次研制用固定化原 生质体生产谷氨酸
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什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
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固定化酶（Immobilized Enzyme）：
共价交联法的基本原理是酶分子和多
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。
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琼脂凝胶包埋法：
将一定量的琼脂加到一定体积的水中， 加热使之溶解，然后冷却至48～55℃，加 入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热 分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形 成球状固定化颗粒，分离后洗净备用。
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海藻酸钙凝胶的包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制 一定浓度的海藻酸钠的溶液，经杀菌冷却 后，与一定体积的酶悬浮液混合均匀，然 后用注射器或滴管将冷凝悬浮液滴到一定 浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化酶 胶粒。
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离子交换吸附法是指在适宜的pH和
离子强度条件下，利用酶的侧链解 离基团和离子交换基间的相互作用 而达到酶固定化的方法。
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最常用的交换剂有CM-纤维素、 DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等； 其他离子交换剂还有各种合成的树脂 如Amberlite XE-97、Dowe X-50 等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理 吸附剂，吸附量 50-150mg/g 载体。
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（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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共价结合法是目前研究中最为活 跃的方法。 它的原理是酶蛋白分子上的功 能基团和固相支持物表面上的反 应基团之间形成共价键，因而将 酶固定在支持物上。
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优点:在于所得到的固定化酶，酶不会 脱落，可以连续使用较长时间。 缺点:载体活化的操作复杂，反应条件 激烈，需要严格控制条件才可以获得较 高活力的固定化酶。同时共价结合会影 响到酶的空间构象，从而对酶的催化活 性产生影响。
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缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难 酶活力有损失 不适于多酶反应
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第二节 酶的固定方法 二、固定化方法
基本原则： 1.必须注意维持酶的催化活性和专一性。 2.酶与载体必须紧密结合，便于回收贮 藏 和反复使用。 3.载体要有相当的机械强度，不可以因 为机械搅拌而破碎或脱落。
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4.固定化酶要有最小的空间位阻，尽 可能不妨碍酶与底物的接近，可以 保证提高产量
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6. 载体： 若载体为非多孔性，则颗粒越小吸附力 越强。若载体为多孔性，要考虑到 吸附对象 的大小和总吸附面积的大小，选择最佳的材 料。
吸附法的优点:
操作简单 可供选择的载体类型多 吸附过程可同时达到纯化和固化的 目的 所得到的固定化酶使用失活后可以 重新活化和再生。
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吸附法的缺点:
最适酶量的选择单凭经验 pH、温度和离子强度的选择对每一 种酶和每一种载体都是各别决定的 酶和载体的间结合力不强会导致催 化活力的丧失和沾污反应产物
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（二）包埋法
包埋法就是将酶物理包埋在高聚物内 的固定化方法。(如将聚合物的单体和酶 溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用 进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到 固定化的目的。） 分为:凝胶包埋法和微囊化法。
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常用的包埋载体:
海藻酸钠、 K-角叉莱胶（卡拉胶）、 明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、 光交联树脂、聚酰氨、火胶棉 1.凝胶包埋法：
5.固定化酶要有最大稳定性，载体不 可与底物、产物发生反应。
6.固定化酶要廉价，以便于工业生产。
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固定化载体的选择：
材料： 无机材料：碳酸钙、氧化铝、硅胶、多空 硅、活性炭、硅藻土、浮石、氧化铁 有机材料：聚乙烯醇、聚乙烯、多酚、聚 苯胺、聚脂、聚苯乙烯 生物材料：蛋壳、纤维素、葡聚糖、海藻 酸盐、几丁质、壳聚糖、琼脂糖
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考虑因素：
1.物理特性： 2.化学性质： 3.稳定性： 4.经济方面的考虑 5.载体对整个反应特性的影响
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新型固定化载体： 1.纳米材料： 50nm～10000nm的聚合 物微球用于共价交联酶、抗体和蛋白 质 用于细胞专一性的传输 2.磁性微球： 3.等离子材料
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二． 酶的固定化方法
关键在于选择适当的固定化方法和 必要的载体以及稳定性研究、改进。 （一） 吸附法 （二）包埋法（entrapping method） （三）结合法 （四）交联法
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酶蛋白在载体上的吸附程度取决于几个 因素: 1. pH：pH会影响载体和酶的电荷变化, 从而影响酶在载体上的吸附。
2. 离子强度：离子强度高，吸附量低。
3. 蛋白质浓度：吸附剂的量一定，随蛋 白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱 和。
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4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减 少吸附，且温度上升会使酶失活加速。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸 附速度要比小分子慢得多。
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（ 2 ）界面聚合法：利用亲水性单体 和疏水性单体在界面发生聚合的原理 包埋酶。
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例如，将含 10 ％血红蛋白的酶溶 液与1，6-己二胺的水溶液混合，立即 在含1% Span-85的氯仿-环乙烷中分散 乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后， 便在油-水界面上发生聚合反应，形成 尼龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有 聚酰胺、聚脲等形成的微囊。
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（四）交联法
交联法是利用双功能或多功能试剂在酶 分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与 载体间进行胶联反应，以共价键制备固定 化酶的方法。 交联法的主要特点是用双功能和多功 能试剂，把酶蛋白分子彼此交叉连接起 来，形成网络结构的固定化酶。
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此法与共价结合法一样也是利用共 价键固定酶的，但条件激烈，酶活低， 应尽量降低交联剂浓度，缩短反应时间。
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图6-1 生物催化剂作用方式示意
典型工业生物技术过程
细胞 酶 空气 除 菌
检测控 制仪表
副产品
产品提取纯化
生物催化剂 （游离或固定化）
生物反应器
（灭菌）
产品 废物
原材料 营养物
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底物
经加工 原料
机械能
热能
培养基
核心技术？
1.1916年Nelson和Griffin，利用活性炭吸 附蔗糖酶，酶的活性和原酶一致 2.1953年，Grubhofer和Schleith采用氨 基苯乙烯树脂为载体，重氮化活化，固 定了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶。（思 路来源与蛋白质活性的固定、抗原及抗 体的固定化） 3.1969年，千钿一郎工业化规模应用固定 化氨基酰化酶连续生产L-氨基酸
（1）界面沉淀法：利用某些高聚物在 水相和有机相的界面上溶解度极低而形 成皮膜将酶包埋。
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例如，先将酶溶液在水不互溶的有 机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存 在下形成油包水的微滴，再将溶于有机 溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入 一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚 物在油—水界面上沉淀、析出、形成膜， 将酶包埋。作为膜材料的高聚物有硝酸 纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯 等。
光交联树脂包埋法
2、微囊化法（又称半透膜包埋法)
将各种浓度、体积或数量的酶封闭 在不同构型的半透膜内的包埋方法。 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质 体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要 用于医学治疗，中空纤维主要适于工 业使用 。 直径10～100um，常用的材料是尼 龙膜和纤维素硝酸膜
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制备微囊型固定化酶有下列几种方法：
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物理吸附法是通过氢键、疏水键和π-电子
亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载 体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化 铝、磷酸钙胶、微孔玻璃等无机吸附剂(1mg 蛋白/g吸附剂) ，纤维素、胶原、面筋、淀粉 以及火棉胶等有机吸附剂(50mg蛋白/g吸附 剂左右) 。
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选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。
共价结合法所用载体分三类
天然高分子有机载体（如多糖、蛋白质、 细胞）； 无机物（玻璃、陶瓷）； 合成高聚物（聚酯、聚胺、尼龙）。 活化方式依载体性质不同而各不相同。
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共价键结合法制备固定化酶的“通 式”
首先载体上引进活泼基团
关键
然后活化该活泼基团
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团 形成共价键
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角叉莱胶包埋法：
将一定量的角叉菜胶悬浮在一定体积 的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至 35～50℃，与一定量的酶悬液混合后， 趁热滴到冷却的氯化钾溶液中，或者先 滴到冷的植物油中，成型后再置氯化钾 溶液中，制成球状固定化酶胶粒。
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聚丙烯酰胺包埋
最常用的包埋法，它的机械强度高，并 可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使 酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱 落。先把单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液 中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联 的高聚物网络。
是指通过物理的或化学的手段，将 酶束缚于水不溶的载体，或将酶 在一定空间内呈闭锁状态存在， 它可以连续地进行反应,反应后的 酶可以回收重复使用。
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第二节 酶的固定方法
一、 固定化酶的优缺点 优点： 多次使用，长期使用 可以装塔连续反应 纯化简单，提高产物质量 有利于控制生产过程 应用范围广 酶的稳定性得到改善
Enzyme Engineering 酶工程
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第五章 固定化酶
第一节 第二节 第三节 定方法 第四节 第五节
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概述 酶的固定方法 微生物、植物、动物细胞的固
固定化原生质体和辅酶 固定化酶的性质
第一节 概述
酶催化(游离酶）的缺点： 1.稳定性差：在高温、强酸、强 碱等外界因素下易失活。 2.酶的一次性使用:反应结束后， 酶即使仍有活性，也难以回收，成本 提高，难于连续化生产。 3.产物的分离纯化较困难：酶与 产物混在一起。
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包埋法的优点： 反应条件 温和、很少改变酶结构的固定 化方法。 包埋法的缺点： 只有小分子底物和产物可以通过高聚物网 架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不 适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产 生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使 活力降低。
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（三）共价结合法：
共价结合法是借助共价键将酶的非活 性必需侧链基团和载体的功能基团 进行结合以制备固定酶的方法。 如此得到的固定化酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使用，是目前应用 和报道得最多的一类方法。但共价 偶联反应一般比较激烈，易使酶变 形失效。
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（3）脂质体包埋法，由表面活性剂和卵 磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物 或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小， 而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可 加快底物透过膜的速度。
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生物细胞也可以作为微胶囊
红细胞：在低渗压的溶液中，红 细胞就会膨胀，膜的通透性变高，血 红蛋白从细胞中渗透出去，酶渗透进 细胞 放回等渗溶液中去，膜的通透性 回复到正常状态，酶就包被在细胞中
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共价结合法中的几个影响因素
1、载体的物化性质要求载体亲水，并且
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有一定的机械强度和稳定性，具备在温和 条件下与酶结合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、 中等离子强度和低温的缓冲溶液中进行。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶 的其它功能基团的影响，副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减 少载体的空间位阻对酶活力的影响。
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共价键结合的固定化方法，是载体结合 法中报道最多的方法。归纳起来有二类：
一是将载体有关基团活化，然后与酶 有关基团发生偶联反应。 另一种是在载体上接上一个双功能试 剂，然后将酶偶联上去。
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可与载体共价结合的酶的功能团有： 或氨基、、或-羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨 基酸残基不应是酶催化活性所必需的， 否则往往造成固定后的酶活性完全丧 失。
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(一)吸附法
•吸附法是最简单的固定化技术，在经济
上也最具有吸引力，只需将酶液与具有 活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。
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吸附法是通过载体表面和酶分子表 面间的次级键相互作用而达到固定目 的的方法。
根据吸附剂的特点又分为两种： 物理吸附(physical adsorption) 离子交换吸附(ion binding)。
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4.1973年，固定化大肠杆菌菌体中的 天冬氨酸酶，生产L-天冬氨酸
5.1976年，法国首次用固定化酵母细 胞生产啤酒和酒精
6.1982年，日本首次研制用固定化原 生质体生产谷氨酸
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什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
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固定化酶（Immobilized Enzyme）：
共价交联法的基本原理是酶分子和多
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。
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琼脂凝胶包埋法：
将一定量的琼脂加到一定体积的水中， 加热使之溶解，然后冷却至48～55℃，加 入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热 分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形 成球状固定化颗粒，分离后洗净备用。
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海藻酸钙凝胶的包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制 一定浓度的海藻酸钠的溶液，经杀菌冷却 后，与一定体积的酶悬浮液混合均匀，然 后用注射器或滴管将冷凝悬浮液滴到一定 浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化酶 胶粒。
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离子交换吸附法是指在适宜的pH和
离子强度条件下，利用酶的侧链解 离基团和离子交换基间的相互作用 而达到酶固定化的方法。
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最常用的交换剂有CM-纤维素、 DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等； 其他离子交换剂还有各种合成的树脂 如Amberlite XE-97、Dowe X-50 等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理 吸附剂，吸附量 50-150mg/g 载体。
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（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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共价结合法是目前研究中最为活 跃的方法。 它的原理是酶蛋白分子上的功 能基团和固相支持物表面上的反 应基团之间形成共价键，因而将 酶固定在支持物上。
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优点:在于所得到的固定化酶，酶不会 脱落，可以连续使用较长时间。 缺点:载体活化的操作复杂，反应条件 激烈，需要严格控制条件才可以获得较 高活力的固定化酶。同时共价结合会影 响到酶的空间构象，从而对酶的催化活 性产生影响。
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缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难 酶活力有损失 不适于多酶反应
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第二节 酶的固定方法 二、固定化方法
基本原则： 1.必须注意维持酶的催化活性和专一性。 2.酶与载体必须紧密结合，便于回收贮 藏 和反复使用。 3.载体要有相当的机械强度，不可以因 为机械搅拌而破碎或脱落。
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4.固定化酶要有最小的空间位阻，尽 可能不妨碍酶与底物的接近，可以 保证提高产量
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6. 载体： 若载体为非多孔性，则颗粒越小吸附力 越强。若载体为多孔性，要考虑到 吸附对象 的大小和总吸附面积的大小，选择最佳的材 料。
吸附法的优点:
操作简单 可供选择的载体类型多 吸附过程可同时达到纯化和固化的 目的 所得到的固定化酶使用失活后可以 重新活化和再生。
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吸附法的缺点:
最适酶量的选择单凭经验 pH、温度和离子强度的选择对每一 种酶和每一种载体都是各别决定的 酶和载体的间结合力不强会导致催 化活力的丧失和沾污反应产物
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（二）包埋法
包埋法就是将酶物理包埋在高聚物内 的固定化方法。(如将聚合物的单体和酶 溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用 进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到 固定化的目的。） 分为:凝胶包埋法和微囊化法。
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常用的包埋载体:
海藻酸钠、 K-角叉莱胶（卡拉胶）、 明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、 光交联树脂、聚酰氨、火胶棉 1.凝胶包埋法：
5.固定化酶要有最大稳定性，载体不 可与底物、产物发生反应。
6.固定化酶要廉价，以便于工业生产。
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固定化载体的选择：
材料： 无机材料：碳酸钙、氧化铝、硅胶、多空 硅、活性炭、硅藻土、浮石、氧化铁 有机材料：聚乙烯醇、聚乙烯、多酚、聚 苯胺、聚脂、聚苯乙烯 生物材料：蛋壳、纤维素、葡聚糖、海藻 酸盐、几丁质、壳聚糖、琼脂糖
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考虑因素：
1.物理特性： 2.化学性质： 3.稳定性： 4.经济方面的考虑 5.载体对整个反应特性的影响
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新型固定化载体： 1.纳米材料： 50nm～10000nm的聚合 物微球用于共价交联酶、抗体和蛋白 质 用于细胞专一性的传输 2.磁性微球： 3.等离子材料
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二． 酶的固定化方法
关键在于选择适当的固定化方法和 必要的载体以及稳定性研究、改进。 （一） 吸附法 （二）包埋法（entrapping method） （三）结合法 （四）交联法
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酶蛋白在载体上的吸附程度取决于几个 因素: 1. pH：pH会影响载体和酶的电荷变化, 从而影响酶在载体上的吸附。
2. 离子强度：离子强度高，吸附量低。
3. 蛋白质浓度：吸附剂的量一定，随蛋 白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱 和。
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4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减 少吸附，且温度上升会使酶失活加速。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸 附速度要比小分子慢得多。
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（ 2 ）界面聚合法：利用亲水性单体 和疏水性单体在界面发生聚合的原理 包埋酶。
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例如，将含 10 ％血红蛋白的酶溶 液与1，6-己二胺的水溶液混合，立即 在含1% Span-85的氯仿-环乙烷中分散 乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后， 便在油-水界面上发生聚合反应，形成 尼龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有 聚酰胺、聚脲等形成的微囊。
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（四）交联法
交联法是利用双功能或多功能试剂在酶 分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与 载体间进行胶联反应，以共价键制备固定 化酶的方法。 交联法的主要特点是用双功能和多功 能试剂，把酶蛋白分子彼此交叉连接起 来，形成网络结构的固定化酶。
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此法与共价结合法一样也是利用共 价键固定酶的，但条件激烈，酶活低， 应尽量降低交联剂浓度，缩短反应时间。
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图6-1 生物催化剂作用方式示意
典型工业生物技术过程
细胞 酶 空气 除 菌
检测控 制仪表
副产品
产品提取纯化
生物催化剂 （游离或固定化）
生物反应器
（灭菌）
产品 废物
原材料 营养物
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底物
经加工 原料
机械能
热能
培养基
核心技术？
1.1916年Nelson和Griffin，利用活性炭吸 附蔗糖酶，酶的活性和原酶一致 2.1953年，Grubhofer和Schleith采用氨 基苯乙烯树脂为载体，重氮化活化，固 定了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶。（思 路来源与蛋白质活性的固定、抗原及抗 体的固定化） 3.1969年，千钿一郎工业化规模应用固定 化氨基酰化酶连续生产L-氨基酸
（1）界面沉淀法：利用某些高聚物在 水相和有机相的界面上溶解度极低而形 成皮膜将酶包埋。
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例如，先将酶溶液在水不互溶的有 机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存 在下形成油包水的微滴，再将溶于有机 溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入 一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚 物在油—水界面上沉淀、析出、形成膜， 将酶包埋。作为膜材料的高聚物有硝酸 纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯 等。