脑垂体细胞培养的研究

・实验研究・

脑垂体细胞培养的研究

史继新　刘承基　王　芳

提要　本研究采用不同的培养方法对经胰蛋白酶消化的BALB C小鼠垂体前叶细胞进行培养,通过电镜与免疫细胞化学染色详细观察了不同培养条件下细胞成分、细胞活力的变化,同时结合培养液中PRL,T SH放免测定,了解细胞成分与细胞活力的改变对细胞分泌功能的影响。结果发现,随着培养时间的延长,垂体细胞的数量逐渐减少,并伴随细胞变性及细胞内分泌颗粒积聚;纯化培养可提高垂体细胞数量;培养垂体细胞的分泌活性与其数量、结构、活力的变化基本一致。

关键词　垂体;　细胞;　培养;　纯化

研究发现,经过培养的组织或细胞免疫原性减低,即使进行异种移植也能成活〔1～4〕。临床上已有用培养垂体细胞移植治疗垂体功能低下的报道〔5〕。但对经过培养的垂体组织细胞成分,细胞活性的改变尚缺乏研究。本研究采用扫描及透视电镜以及细胞免疫组织化学方法对不同方法培养的垂体细胞进行观察,以了解分散的垂体组织经培养后细胞成分及细胞活力的变化,同时测定培养细胞的分泌活性,以观察细胞成分与细胞活力的改变对细胞分泌活性的影响。α

1　资料与方法

1.1　实验动物　纯系BALB C小鼠,H22d 品系,鼠龄1～2个月,体重20g左右。

1.2　垂体组织的消化　无菌条件下切取垂体前叶,剪碎后采用两种条件消化:①0.25%胰蛋白酶溶液,37℃,消化5～10m in;②0.15%溶液,4℃,20h。分散细胞,用含15%小牛血清的1640培养液或M E M F12混合培养液调整细胞浓度为1×105 m l。

1.3　垂体细胞的培养　将垂体细胞接种于玻璃培养瓶或24孔培养板中,加入含20%小牛血清的1640培养液或M E M F12混合培养液,置37℃5%CO2孵箱中培养。本组采用三种培养方法:

1.3.1　传代培养:将细胞悬液接种于玻璃培养瓶或24孔培养板中,其细胞浓度为维持培养的1 3。待细胞长满瓶底后,用0.25%胰蛋白酶溶液消化后传代,维持培养期21～30天。

1.3.2　纯化培养:利用成纤维细胞先贴壁以及对胰蛋白酶消化较上皮细胞敏感的原理对垂体细胞进行纯化〔6〕。维持培养期30天。

1.3.3　维持培养:将细胞悬液接种于24孔培养板中,每孔细胞约3×104,每三天更换培养液,维持培养30天。

1.4　垂体细胞的证实　部分培养细胞分别在培养后3,7,14,21及28天作透射电镜及扫描电镜检查,以观察培养细胞的表面变化和细胞形态、细胞活力及细胞成分的改变。并取生长于盖玻片上的细胞进行催乳素(PRL)、促甲状腺激素(T SH)、生长激素(GH)、促皮质激素(A CTH)免疫组化染色,以观察每种细胞的含量及形态。

1.5　培养垂体细胞的分泌活性　分别于培养后3,7,14,21及28天留取培养上清液,然后每孔加入促甲状腺激素释放激素(TRH,

α神经外科

终浓度1m g L ),2.5h 后再取上清液,分别进行PRL 及T SH 放免测定。2　结 果

经低浓度胰蛋白酶消化获得的分散垂体细胞具有死细胞少、细胞生长活力强、易于贴

壁等特点,生长能力显然优于高浓度胰酶常温下短时间消化所获得的细胞。

传代培养细胞增殖迅速,常在24h 内贴壁,48h 后即呈对数生长,一般7天左右需进行传代。培养的上皮细胞呈圆形或多角形,其间穿插有大量长梭形或不规则形,体积较大的细胞。上皮样细胞可形成细胞团。随着传代与培养时间的延长,上皮样细胞的数量逐渐减少,而被体积较大的长梭形与不规则形细胞取代。纯化培养的细胞贴壁时间相对较长,常需48～72h 左右,细胞贴壁后最初几天,可见较多分裂期细胞,继续培养则见由上皮细胞形成的细胞岛。不断增大,其间夹杂少量的长梭形细胞(图1)。

如每次传代均行纯化可增加上皮细胞数量,但纯化后的细胞生长能力逐渐减退,不易贴壁,常需在培养瓶底涂布鼠尾胶原才能贴壁,所需传代时间较长。维持培养由于细胞浓度密集,其形态多为圆形,体积较小。由于细胞间的接触抑制,即使维持长达3～4周,垂体细胞仍占主导地位,且常形成典型上皮细胞团

。

图1 相差显微镜下纯化培养后第25天的垂体

细胞,示垂体细胞形成的细胞岛及成纤维样细胞

经过培养的分散垂体组织扫描电镜检查主要有两种形态,一种是体积较大,形状不规则,表面伸出多而长突起的细胞;另一种体积较小,圆形表面突起多而短(图2),两种细胞成分在不同的培养条件及不同的培养时间含量不同。透射电镜下,大而长突起的细胞内不含分泌颗粒;其余细胞含有分泌颗粒,系垂体细胞,其体积较培养前增大,细胞膜表面突起较培养前明显增加。培养后3天左右,多数垂体细胞仅含少量分泌颗粒,胞浆内充满大量层状排列的粗面内质网。随着培养时间的延长,细胞内分泌颗粒逐渐增多,细胞器减少,同时,见细胞变性,尤其在培养第四周以后,这些改变更加突出,部分细胞甚至出现细胞核溶解,胞膜碎裂等不可逆性改变。免疫细胞化学染色显示,传代培养培养至7天后

,

图2 培养垂体细胞扫描电镜检查

A 培养前,细胞体积较小,表面光滑;

B 培养后第14天,体积较培养前增大,细胞表面突起明显增加

免疫阳性细胞数量已经明显减少,培养至14天后,免疫阳性细胞已不足30%。纯化培养细胞在培养至21天后,免疫阳性细胞仍可达70%以上,以PRL 细胞为主,多聚集成片,可见双核和多核细胞。

培养垂体细胞的分泌活性:在传代培养

条件下,培养上清液内

PRL ,T SH 含量均随培养时间延长而减低,至培养两周后即失去对TRH 刺激的反应;纯化培养PRL ,T SH 的分泌及其对TRH 刺激的反应结果见图3,图4;维持培养的细胞PRL 与T SH 的浓度与纯化培养大致相同。

图3 纯化培养的垂体细胞的分泌活性 图4 纯化培养的垂体细胞的分泌活性

(TRH 刺激前后PRL 浓度的变化)

(TRH 刺激前后T SH 浓度的变化)

3　讨 论

经胰酶消化所获得的细胞含有一定量的成纤维细胞,体外培养时,成纤维细胞的增殖能力远远超过上皮细胞,如何获得较为纯净的垂体细胞仍是尚未解决的问题。无血清培养基可抑制成纤维细胞的生长〔7〕,但适合垂体细胞生长的无血清培养基配制较为复杂。本实验利用成纤维细胞先贴壁及其对胰酶消化较为敏感的原理对垂细胞进行纯化,也能获得较多数量的垂体细胞。

不同的培养方法对垂体细胞的生长活性及垂体细胞的数量有显著影响。传代培养的垂体细胞数量随着培养时间的延长减少最为突出,至培养后7～14天,培养瓶内已被大量增殖的成纤维细胞占据,垂体细胞数量显著减少,并可见明显细胞变性。纯化培养可部分解决垂体细胞数量减少的问题,但随着培养时间的延长,仍不能完全克服成纤维细胞的增殖。且较长时间培养后也会出现细胞变性

改变。维持培养由于正常细胞的接触抑制,成纤维细胞不能大量增殖,因此即使维持培养3～4周,垂体细胞亦不见明显减少。另外,不同的组织消化方法对垂体细胞的生长也有影响,低浓度胰酶在4℃下消化得到的分散垂体细胞生长活力显然远远大于较高浓度胰酶在37℃下消化所获得的细胞。

培养后的垂体细胞形态呈现显著改变。培养数天后,细胞表面即出现大量突起,随着培养时间的延长,突起更加增多且加深,反映出细胞为了适应生存环境,通过增大自身表面积从而尽可能多的获得足够的营养物质。培养初期,多数细胞内分泌颗粒减少,伴之大量粗面内质网增加,提示此期垂体细胞的合成与分泌功能均较旺盛。但是,随着培养时间的延长,多数细胞内逐渐积聚大量分泌颗粒,而粗面内质网及高尔基器减少,培养3周后的细胞尤为突出。这可能是细胞缺乏足够的下丘脑激素的刺激,使分泌颗粒不能外排。但结合同时出现的细胞变性改变,也提示较长