测定多糖的方法

测定多糖的方法：蒽酮—硫酸法，苯酚—硫酸法，比色定量法，纸色谱法，离子交换色谱法，酶法，原子吸收法，HPLC法，DNS（还原法），磷钼比色法。

一、苯酚—硫酸法
1、原理：糖在浓硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合
物。

在10～100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。

在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在波长下测定。

苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法。

简单，灵敏度高，实验室基本不受蛋白住存在的干扰。

2、实验药品
浓硫酸苯酚
3苯酚溶液的配制
（1）先配制80%苯酚溶液，然后称取80.0g苯酚加20.0g水，使之溶解，置于冰箱中，避光长期保存。

取80%苯酚37.5mL定容到500Ml.配制成60%的苯酚溶液，避光保存。

（2）取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏收集182℃馏分。

称取7.5g加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。

二、蒽酮—硫酸显色法
1、实验药品
蒽酮硫酸
2、溶液的配制
称取蒽酮0.2g，加浓硫酸100mL混均即可（现用现配）
三、高效液相色谱法
多糖溶液进行高效液相色谱，利用TSK—GEL G4000PW柱.RI—10A示差折光检测器，以双蒸馏水为流动相，溶液浓度为0.5mg/Ml,进样量50μL，根据峰形判断样品的纯度。

四、DNS法
为排除还原性单糖的干扰，可采用DNS（3,5—二硝基水杨酸）比色法测定还原糖的含量。

1、原理在碱性溶液中3,5—二硝基水杨酸与还原性糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。

再将通过硫酸—苯酚，或者蒽酮—硫酸法得到的总糖结果减去还原糖，即得较准确的多糖含量。

五、地衣酚—硫酸法
溶液的配制
称取400mg地衣酚（3，5—二羟基甲苯）溶于155mL浓盐酸中，另加45mL含0.33%三氯化铁的0.01mol·mL_1盐酸，临用前配制。

苯酚—硫酸法和蒽酮—硫酸法的缺陷：首先葡萄糖是单糖而植物多糖的组成是多样的，只是用葡萄糖作为参照不确切，其次，显色试剂的不专属单糖的干扰严重，实际上测得的结果是总糖的结果。

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5一二硝基水杨酸法(简称DNS法)
DNS法测定原理基于在一定的范围内，还原糖的含量和反应液颜色成比例关系，利用比色法可测定多糖的含量。

对没有还原性的多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行定。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3一氨基一5一硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定吸光度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0．9。

DNS比色法中，色素等还原性物质可与DNS显色剂显色，采用水解前测定值校正水解后测定值的方法简便、有效地排除了色素等杂质的干扰。

DNS法测多糖含量具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点。

4萨氏(Somogyi—Nelson)法
将多糖酸水解为还原糖，还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在的情况下，可以定量地将二价铜离子还原为一价铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。

氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，在620nm波长下比色，其颜色深浅在一定范围内与还原糖含量(即被还原的氧化亚铜Cu2()量)成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，620rim波长下比色后用做标准，就可测得样品中还原糖含量。

5斐林试剂比色法
单糖和多糖的水解物都含有具还原性的醛基或是酮基，在碱性条件下煮沸能使斐林试剂中的二价铜离子还原为一价的氧化亚铜，而使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。

据此，在590nm波长处测定不同情况下溶液的吸光度，并制作标准曲线，可求出样品中糖的含量。

此法的优点是操作简便，斐林试剂可不作定量配制，测定误差在-I-0．02％，但须经常作标准曲线校正。

缺点是试剂不稳定，需临时配制，且容易受肌肝(酸)等的干扰，这在医疗分析上很不利。

其测定范围在0．1—0．5mg／mL还原糖，如果含糖量超过此范围，误差显著增大。

目前多糖含量测定的方法很多，仅比色法还有硫酸咔唑法、地衣酚硫酸法、对羟基苯甲酰肼法、亚甲基蓝比色法等。

今后，随着科学技术的发展，许多快速、简便、准确的新分析方法将在多糖含量测定中得到广泛应用。