荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用
荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。

其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。

2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。

3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。

下面介绍常用的几种检测方法：
1、双链DNA内插染料
某些染料如SYBR GreenⅠ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。

在PCR过程中SYBR GreenⅠ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合
SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。

要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。

在此前提下，本法
是一种成本低廉的选择。

2、TaqMan探针技术原理
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。

所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步
指数增长的过程。

信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

5，TaqMan探针的荧光信号产生机制
根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。

MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。

因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。

因为在模板的DNA 碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

实验证明，TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

TaqMan MGB探针
探针设计一般应符合以下条件：1、探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。

2、G、C碱基含量在40％-60％，避免单核苷酸序列的重复。

3、避免与引物发生杂交或重叠。

4、探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。

3、分子信标技术
分子信标技术（molecular beacon）也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是该探针5′和3′末端自身可形成一个8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。

当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET消失，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。

Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

研究表明,每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1、双链DNA内插染料
常用的是SYBR Green I荧光染料，其技术原理：SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的
净增量加大。

荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪。

荧光染料法实质上是常规的PCR反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA的结合所发出的荧光实时监控反应的进程。

由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件，价格低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪，因而同样得到广泛采用。

在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。

荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。

在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。

基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。

随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。

对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。

溶解峰可以反映反应中扩增到的
产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量检测了。

的RNA模板做10倍倍比稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度，将强毒株H
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然后按下面的公式转换成模板的拷贝数：拷贝数=NDV模板浓度×阿氏常数／(一个碱基的平均分子量×NDV模板的总长度)其中，阿氏常数为6.02×1023，一个碱基的平均分子量为324.5，NDV模板的总长度为15 186 bp，标准品的RNA模板分别进行10－1、10－2 、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7稀释后，用紫外分光光度计测定病毒RNA模板的OD值，分别计算其浓度，用于制作标准曲线，同时做一个阴性对照。