绿色荧光蛋白分子标记的研究现状 - 副本(1)

绿色荧光蛋白分子标记的研究现状王枝平赵天垚马胡坚2012311535
摘要近年来, 来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。

其中，来源于水母的绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP) 分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法,对于目前在各个研究领域有很好的应用价值。

目前，GFP在微生物降解污染物、环境生态学和环境检测生物等领域取得了很好的应用效果。

关键词绿色荧光蛋白分子标记应用价值
序言近年来，荧光蛋白基因标记技术是迅速发展的一种新型细胞示踪技术。

其中，绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是应用最广泛的标记基因，在GFP基因标记后，在特定波长激发下，细胞可以强烈而持久地发出绿色荧光，同时保持良好活性，体内单个荧光细胞亦可用多种方法敏感地检测出来。

GFP是一种良好的标记物, 表达对寄主细胞无毒性作用, 可连续培养。

表达后, 能自发产生荧光蛋白, 可借助荧光体视镜和荧光显微镜进行活体实时定位观察。

目前, GFP 已被广泛应用到真菌的研究中, 并也取得了前所未有的成果【1-2】。

传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上, 但是化学计量和染料附着的部位难于控制, 因此尚需再次纯化。

正是由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质, 且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光, 使其在生命科学中的应用具有美好的前景。

本文就其研究进展进行简要综述。

一：绿色荧光蛋白的基本结构与性质
绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)最早是由Shimomure [3]等在1962年时由多管水母中提取而来.后来Prasher 等人在 1992 测得，为 238 个氨基酸残基组成，
分子量约27kDa。

其折叠结构为一（高×直径）的β筒状结构，筒状结构两端由一些较短的α螺旋盖住，生色团位于筒状结构中央，生色团完全被包覆，处于β筒状结构内部的氢键网络中，三维结构的形成与生色团的固定以及GFP的荧光有非常紧密的关系:一是保护了生色团免遭分子氧的淬灭；二是防止生色团形成过程中处于激发态的中间体的构象翻转[4]。

二 GFP的生物发光原理
早在六十年代初期, Shimomura 等[3]首先从多管水母属(Aequorea victor ia) 中分离出一种称为 Aequorea 的蛋白, 该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光, 当时称为光蛋白(Photoprotein)。

它是分子量为 20kD 的单一多肽链, 在其发光前, 1Mol 的 Aequoria 结合 3Mol的钙离子及 1Mol 非共价键结合的腔肠动物荧光素。

尽管光蛋白体系本身发射蓝光, 然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色, 推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。

Morise等[4]对 GFP 进行了分离和纯化, 他们的实验结果表明, GFP 的荧光发射峰在 509nm, 最大激发波长为 395nm, 并在 475nm 处有一肩峰。

当将 Ca 2+加入到含低浓度 GFP 的 Aequorin 溶液中时, 光谱接近于Aequorin 发射的蓝光( K max472nm); 而将 Aequorin 和GFP 按大自然比例混合时, 加入Ca2+, 则光谱接近于活体的发射光(K max 509nm)。

推测在活体内, GFP 通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程, 吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光[5]。

总的说来，Shimomura在发现GFP中作出了重要的贡献，如对其纯化和物理化学表征等方面,以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等.他们说明了GFP可以作为一种能量受体以及Aequorin作为能量给体,而在二者间发生了Forster的能量转移,并解释了由GFP发射的是绿光而不是蓝光.他们还正确的指认了与GFP多肽链体的发色团的不同功能部分.而如果没有这些Shimomura开创性的经典工作,有关GFP的出现和广泛应用将推迟几十年,甚至至今它仍作为
一种秘密保留在太平洋中[111]。

三: 绿色荧光蛋白分子标记技术
由于绿色荧光蛋白分子受到蓝光照射时会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。

利用这一性质，可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，作为一种新型的报告基因。

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重GFP标记的微管组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

而且GFP 的荧光产生不需要任何水母中特别组分的参与，蛋白质序列本身已经包含了GFP 发光所需的信息[5，6]。

Tsien[7]等人表明生色团的形成不需要任何酶或辅助因子的参与，而只需氧分子的存在。

GFP 在DNA 内至少都有 3 个启动子。

将其与目的基因结合后，对宿主细胞的功能结构基本无影响及毒副作用。

当其在细胞内得到表达后，在蓝光的照射下，可以发出荧光，并借助荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜即可对活细胞进行实时定位观察，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

1994 年，Chalfie 等人[5]首次在原核的大肠杆菌中表达了具有荧光性的 GFP，Inouye 和 Tsuji[6]则在秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的 GFP。

四：GFP 基因的改进
绿色荧光蛋白作为分子探针有很多优越性，但还是有局限性，如绿色荧光蛋白质的折叠会被温度影响，激发峰强度比较小，可以会不易被监测到，科学家通过野生型 avGFP 的随机突变和定点突变得到了让荧光更加稳定及明亮、温度敏感性及溶解性得到明显改善的突变体，甚至还可以得到别的颜色的荧光蛋白，扩大其的应用范围。

突变体的获得主要有以下几种[8]：1.去除掉基因中的隐蔽的内含子；2.改变某些碱基的组成； 3.将绿色荧光蛋白的生色团氨基酸进行替换；4 .插入植物性的内含子； 5 .替换为较强的启动子。

常见的 GFP 突变体有[8]：（1）增强型 ,GFP（2）人工 GFP，（3）蓝色荧光蛋白,（4）红移荧光蛋白。

总的来说，绿色荧光蛋白标记法对现在起着很大的作用，但对于提取液和提取的物质是绿色的样品可能会出现一定的影响。

此时，我们还可以用其他颜色的标记法来验证。

在进行标记的时候，我们还应该考虑到是否还有其他生色团在起作用，在实验之前我们要尽量避免。

五：绿色荧光蛋白分子标记技术应用
绿色荧光蛋白作为最有效的活细胞标记物质，目前已经广泛应用于基因表达标记及调控、蛋白质定位、胚胎发育、分子生物学、生物传感器、生物探针和生物成像等领域。

绿色荧光蛋白(GFP)可直接进行活体观察, 它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。

贾洪革等[9]借助 GFP荧光的消失, 快速选出 nptII 被消除的二次转化体，成功的利用绿色荧光蛋白监测转基因植
物中选择标记基因的消除。

高苒[10]等利用绿色荧光小鼠和红色荧光 RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互。

六：结束语
绿色荧光蛋白分子标记技术已经广泛用于各个领域,宏观领域上,可研究病原菌的防效,微观领域上,可研究蛋白质功能、细胞亚结构、病原菌与寄主的关系、基因表达等。

绿色荧光蛋白不仅运用在微生物、植物等范围，还运用在人类身体里有些器官的研究。

绿色荧光蛋白分子标记法对科研者研究各方面都起着不可替代的作用。

同时，我们可以看到:他们所获得的有着其深厚的科学背景,正是由于有大量科学工作者对这一重要科学现象持续不断的兴趣和从各个方面所做的不懈努力,从而积累起广泛而深厚的基础,方能在今天,使我们对这一问题能有较深入了解,以及作为其中的杰出代表人物能获此殊荣.这正如牛顿所说的:“我之所以看得比别人更远些,是因为我是站在巨人的肩上”.因此看来,要真正认识宇宙的奥秘,使国人在世界科学研究中有更大的贡献,广泛科学水平的提高是不容忽视的。

[1] 徐莹, 刘太国, 何月秋, 等. 绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用[ J] . 植物保护, 2008, 34( 6) : 1 -6.
[2] 徐进, 莫明和, 张克勤. 绿色荧光蛋白GFP 在真菌研究中的应用[ J] . 生物技术, 2004, 14( 6) : 74 -77.
[3] Shimomura O , Johson FH , Saiga Y et al . J Cell .Comp. Physiol, 1962; 59: 223.
[4] 岳莉莉,齐义鹏武汉大学病毒学研究所, 绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物,《生物工程进展》1997,Vol. 17, No. 4.
[3]Shimomura O. Structure of the chromophone of Aequorea green fluorescent protein[J] FEBS Letters,1979,104:220-222
[4]王建国。

绿色荧光蛋白生色团的荧光增强及其在细胞成像中的应用。

[5] Chalfie, M., Tu, Y.，Euskirchen, G., Ward, W.W., Prasher, D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression [J]. Science. 1994, 263(5148): 802-805.
[6] Inouye, S., Tsuji, F. I. Aequorea green fluorescent protein: Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein [J]. FEBS Letters. 1994, 341(2-3): 277-280.
[7] Heim, R., Prasher, D.C., Tsien, R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1994, 91(26): 12501-12504.
[8] 吴雨娟，绿色荧光蛋白作为标记蛋白在胰岛素表达的初步研究[D].广西医科大学，
[9]1 吕玲飞,庞永奇,陈晓英,方荣祥.用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除[J]生物工程学报.2004 .1:11-15.
[10]高苒, 刘学丽, 冯娟, 张连峰.荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用[j].中国比较医学杂志2008 .5 （18）60-65.
[111] 吴世康绿色荧光蛋白质(GFP)的发现、表达和发展第27卷第1期影像科学与光化学Vol.27 No.1 2009年1月,69-78.。