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体的再生率。
真菌的最适酶解温度为30℃～35℃。一般来说，最适 酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。
酶解时间也是原生质体制备过程中一个非常重要的因
素。由于酶液中含有一些蛋白酶，酶解时间过长会对一些
早期释放的原生质体膜造成损坏，而导致原生质体破裂。
因此酶解时间不宜过长。 本实验中木霉菌以PDB培养基培养14h，以0.7mol/L NaCl为稳渗剂，25mg/mL的Lywallzyme，30℃酶解3.5h 得到大量的原生质体。
一 材料与方法 （一）供试材料
拟康氏木霉（Trichoderma koningii）为农学院病理实
验室保藏菌种；质粒 pUCATPH由中国农业大学彭友良教 授馈赠（来自山东农业大学） (含有潮霉素磷酸转移酶基 因 hph和真菌表达启动子 PtrpC)。
（二）试验方法
1.质粒pUCATPH的扩增、 提取
接种→培养→提取
2.质粒pUCATPH的线性化
质粒DNA用适当的限制性内切酶于37℃酶切，消化4h
后，电泳观察。
3 . 木霉原生质体的制备
接种→培养→刮霉→培养→收集→酶解
3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响 供试菌株菌丝培养时间分别为10，12，14，16，18， 20和22h其他操作同3。
（二） REMI转化
限制酶介导的插入突变机理尚不十分清楚。可能是在 转化过程中，限制性酶和线性化质粒DNA一起进入细胞中， 真菌染色体DNA的相应限制性酶位点被切开，尽管大多数 切点没有整合外源DNA而重新连接，但有可能外源DNA片 段的粘性末端与染色体DNA的粘性末端连接而插入，切口
由DNA连接酶封闭后形成转化子，外源DNA可造成插入位
1.4酶解温度对原生质体制备的影响
该图可见随着酶解温 度的增加，原生质体 的产量逐渐增加，酶 解温度为30℃时，原 生质体产量最大，但 温度再升高，原生质 体产量下降。
2.制备出的原生质体观察
由图可见，康 氏木霉原生质 体呈圆形或椭 圆形，而且制 备量很大。
（二） REMI转化
对于木霉菌，采用限制性内切酶KpnⅠ、
Hind Ⅲ每 µg质粒可获得5～6 个转化子，SacⅠ每
µg质粒有转化子1～2个，转化效率较低。本实验
考虑经济因素，决定用采用 Hind Ⅲ酶介导转化， 经过潮霉素筛选，能正常生长的初步断定为转化 子，共获得15个转化子。
该图为转化 子和出发菌 株个体形态 对比。
如图所示生长成的 表型突变体，菌落 圆形，呈白色，菌 丝浓密。
其他操作同3。
4. 木霉原生质体的遗传转化
本实验采用的是采用REMI转化方法对木霉进行的转 化。
返回
二 结果与分析
（一）原生质体的制备
1.不同条件对原生质体的影响
1.1菌丝培养时间对原生质体制备的影响
从该图可以看出，用于制备 木霉原生质体的菌丝最佳培 养时间为14h左右，菌丝量 可基本满足，也不太老化制 备量最多。
返回
三 结论与讨论 （一）影响原生质体制备的因素
适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓 度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类，随着酶 量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时 必然会影响原生质体的活性，酶浓度过大，易使菌体凝集，
难于原生质体化，而且细胞脱壁最彻底，必然降低原生质
木霉教学
报告内容
• • • • •
1.前言 2.材料与方法 3.结果与分析 4.结论与讨论 5.参考文献 6.致谢
一 前言
木霉（Trichoderma）是近年来研究较为广泛 的一种生防菌 ,它对植物具有很好的防病、促生作 用。目前木霉生防菌的研究已经向着基因水平发 展 ,利用基因工程技术、原生质体融合技术等分子 生物学手段构建生防木霉工程菌 ,已成为现在木霉 研究的热点 。其中基因工程技术被认为是最有效 的菌株改良途径，成为研究生防真菌生物学的基 础。
真菌转化常用技术主要是 REMI(restriction enzymem ediatedintegration)转化和 ATMT(agrobacteriumtumefaciensm edi ated transformation)转化。 本实验通过反复培养木霉菌丝、提取原生 质体以及遗传转化筛选转化子，旨在寻找木霉 原生质体制备以及遗传转化的最佳条件，为进 一步研究木霉的相关问题奠定基础。
3.2 酶浓度对原生质体制备的影响
分别采用5，10，15，10，25，30和
35mg/mL酶浓度制备原生质体，其他操作同3。
3.3 酶解时间对原生质体的制备的影响
菌丝于酶溶液中分别酶解1，1.5，2，2.5，3，
3.5，4，4.5，和5h，其他操作同3。
3.4 酶解温度对原生质体的制备的影响
酶解温度分别为15℃，20℃，25℃， 30℃和35℃，
点的基因失活，通过对转化子的表型筛选即可获得突变株。
Hale Waihona Puke 返回四 参考文献[1]宋晓妍,孙彩云,陈秀兰,等.木霉生防作用机制的研究进展 [J]. 中国农业科学报,2006,8(6):20-25. [2]黄玉茜,梁春浩,陈捷.绿色木霉菌T23原生质体的制备和 再生 [J].吉林农业大学学报， 2007,29(1):24-27. [3]峥嵘,张功.绿色木霉原生质体的制备与再生研究 [J].内蒙古师 范大学学报,2002,2(31):145-149. [4]曹玉桃,彭化贤,文成敬,等.木霉生防菌 T25与T55原生质体形 成与再生条件的研究[J]. 西南农业学报,2007,20(5):997-1000. [5]赵乐辉，李 颖，吕淑霞.木霉T21和T22原生质体制备和再生 研究[J].沈阳农业大学学报，2005-02，36（1）：96-98. [6]Huang W,Wang TH, Wu ZH, etal.Advance ingene tic transfor mation system of Filamentous fungi (in Chinese)[J]. Journal of Microbiology (微生物学杂志),2000, 20(3):40-44.
1.2 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响
由该图可见随着酶 浓度的增加，原生 质体的产量也增加， 在 25mg/mL 左右酶 浓度时，原生质体 产量大到最高。
1.3酶解时间对原生质体制备的影响
随着酶解时间的延长， 原生质体产量逐渐增 加，在 3.5h 左右时达 到最大，之后开始减 少，见左图，因此， 合适的酶解时间为 3.5h左右。
真菌的最适酶解温度为30℃～35℃。一般来说，最适 酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。
酶解时间也是原生质体制备过程中一个非常重要的因
素。由于酶液中含有一些蛋白酶，酶解时间过长会对一些
早期释放的原生质体膜造成损坏，而导致原生质体破裂。
因此酶解时间不宜过长。 本实验中木霉菌以PDB培养基培养14h，以0.7mol/L NaCl为稳渗剂，25mg/mL的Lywallzyme，30℃酶解3.5h 得到大量的原生质体。
一 材料与方法 （一）供试材料
拟康氏木霉（Trichoderma koningii）为农学院病理实
验室保藏菌种；质粒 pUCATPH由中国农业大学彭友良教 授馈赠（来自山东农业大学） (含有潮霉素磷酸转移酶基 因 hph和真菌表达启动子 PtrpC)。
（二）试验方法
1.质粒pUCATPH的扩增、 提取
接种→培养→提取
2.质粒pUCATPH的线性化
质粒DNA用适当的限制性内切酶于37℃酶切，消化4h
后，电泳观察。
3 . 木霉原生质体的制备
接种→培养→刮霉→培养→收集→酶解
3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响 供试菌株菌丝培养时间分别为10，12，14，16，18， 20和22h其他操作同3。
（二） REMI转化
限制酶介导的插入突变机理尚不十分清楚。可能是在 转化过程中，限制性酶和线性化质粒DNA一起进入细胞中， 真菌染色体DNA的相应限制性酶位点被切开，尽管大多数 切点没有整合外源DNA而重新连接，但有可能外源DNA片 段的粘性末端与染色体DNA的粘性末端连接而插入，切口
由DNA连接酶封闭后形成转化子，外源DNA可造成插入位
1.4酶解温度对原生质体制备的影响
该图可见随着酶解温 度的增加，原生质体 的产量逐渐增加，酶 解温度为30℃时，原 生质体产量最大，但 温度再升高，原生质 体产量下降。
2.制备出的原生质体观察
由图可见，康 氏木霉原生质 体呈圆形或椭 圆形，而且制 备量很大。
（二） REMI转化
对于木霉菌，采用限制性内切酶KpnⅠ、
Hind Ⅲ每 µg质粒可获得5～6 个转化子，SacⅠ每
µg质粒有转化子1～2个，转化效率较低。本实验
考虑经济因素，决定用采用 Hind Ⅲ酶介导转化， 经过潮霉素筛选，能正常生长的初步断定为转化 子，共获得15个转化子。
该图为转化 子和出发菌 株个体形态 对比。
如图所示生长成的 表型突变体，菌落 圆形，呈白色，菌 丝浓密。
其他操作同3。
4. 木霉原生质体的遗传转化
本实验采用的是采用REMI转化方法对木霉进行的转 化。
返回
二 结果与分析
（一）原生质体的制备
1.不同条件对原生质体的影响
1.1菌丝培养时间对原生质体制备的影响
从该图可以看出，用于制备 木霉原生质体的菌丝最佳培 养时间为14h左右，菌丝量 可基本满足，也不太老化制 备量最多。
返回
三 结论与讨论 （一）影响原生质体制备的因素
适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓 度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类，随着酶 量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时 必然会影响原生质体的活性，酶浓度过大，易使菌体凝集，
难于原生质体化，而且细胞脱壁最彻底，必然降低原生质
木霉教学
报告内容
• • • • •
1.前言 2.材料与方法 3.结果与分析 4.结论与讨论 5.参考文献 6.致谢
一 前言
木霉（Trichoderma）是近年来研究较为广泛 的一种生防菌 ,它对植物具有很好的防病、促生作 用。目前木霉生防菌的研究已经向着基因水平发 展 ,利用基因工程技术、原生质体融合技术等分子 生物学手段构建生防木霉工程菌 ,已成为现在木霉 研究的热点 。其中基因工程技术被认为是最有效 的菌株改良途径，成为研究生防真菌生物学的基 础。
真菌转化常用技术主要是 REMI(restriction enzymem ediatedintegration)转化和 ATMT(agrobacteriumtumefaciensm edi ated transformation)转化。 本实验通过反复培养木霉菌丝、提取原生 质体以及遗传转化筛选转化子，旨在寻找木霉 原生质体制备以及遗传转化的最佳条件，为进 一步研究木霉的相关问题奠定基础。
3.2 酶浓度对原生质体制备的影响
分别采用5，10，15，10，25，30和
35mg/mL酶浓度制备原生质体，其他操作同3。
3.3 酶解时间对原生质体的制备的影响
菌丝于酶溶液中分别酶解1，1.5，2，2.5，3，
3.5，4，4.5，和5h，其他操作同3。
3.4 酶解温度对原生质体的制备的影响
酶解温度分别为15℃，20℃，25℃， 30℃和35℃，
点的基因失活，通过对转化子的表型筛选即可获得突变株。
Hale Waihona Puke 返回四 参考文献[1]宋晓妍,孙彩云,陈秀兰,等.木霉生防作用机制的研究进展 [J]. 中国农业科学报,2006,8(6):20-25. [2]黄玉茜,梁春浩,陈捷.绿色木霉菌T23原生质体的制备和 再生 [J].吉林农业大学学报， 2007,29(1):24-27. [3]峥嵘,张功.绿色木霉原生质体的制备与再生研究 [J].内蒙古师 范大学学报,2002,2(31):145-149. [4]曹玉桃,彭化贤,文成敬,等.木霉生防菌 T25与T55原生质体形 成与再生条件的研究[J]. 西南农业学报,2007,20(5):997-1000. [5]赵乐辉，李 颖，吕淑霞.木霉T21和T22原生质体制备和再生 研究[J].沈阳农业大学学报，2005-02，36（1）：96-98. [6]Huang W,Wang TH, Wu ZH, etal.Advance ingene tic transfor mation system of Filamentous fungi (in Chinese)[J]. Journal of Microbiology (微生物学杂志),2000, 20(3):40-44.
1.2 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响
由该图可见随着酶 浓度的增加，原生 质体的产量也增加， 在 25mg/mL 左右酶 浓度时，原生质体 产量大到最高。
1.3酶解时间对原生质体制备的影响
随着酶解时间的延长， 原生质体产量逐渐增 加，在 3.5h 左右时达 到最大，之后开始减 少，见左图，因此， 合适的酶解时间为 3.5h左右。