植物愈伤组织培养

植物愈伤组织培养

学院：生命科学技术学院

班级：08级生物工程

教师：臧忠婧

姓名：邢宏堃

学号：20084082028

植物愈伤组织培养

摘要：将一个植物细胞、一块植物组织或一个植物器官的细胞，通过去分化形成愈伤组织，并在体外培养使之再分化成植株的技术称之为植物愈伤组织培养。而植物愈伤组织的培养离不开植物组织培养。植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。本次试验以胡萝卜的形成层为材料，培养其愈伤组织。

关键词：胡萝卜，愈伤组织，植物组织培养，脱分化

实验目的1 掌握植物培养的相关理论知识2掌握组织培养的操作方法3了解不同激素及其比例对愈伤组织的再分化作用。

试剂及仪器

（一）仪器设备

超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、电子天平、移液器（1-5ml）、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶（500ml、100ml）、量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（1000ml、100ml）、长镊子、记号笔、培养皿、酒精灯、打孔器

（二）试剂

75% 酒精、次氯酸钠（或H2O2）、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、烟酸、盐酸-硫胺素（VB1）、盐酸-吡哆醇（VB6）、肌醇、甘氨酸

（三）试验材料新鲜的胡萝卜

实验步骤

（一）培养基配制

1. 培养基的选择

植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。

无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA （吲哚乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、NAA（萘乙酸）、NOA （萘氧乙酸）、P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（苄氨基嘌呤）、6-BA（苄基腺嘌呤）、2-Zi（异戊烯氨基嘌呤）、KT（激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。

培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基种类繁多，最基本、最常用的培养基为MS 培养基。

2. 培养基的配制

①先配制MS培养基贮液，②再将贮液与其他成分按比例混合。③此外还需

加入适量的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉，适量的生长调节剂等。④将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 调节培养基的pH值至最适。⑥分装至三角烧瓶，封口膜封口，等待灭菌后使用。

3. 几种诱导愈伤组织的培养基

胡萝卜MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA

玫瑰叶盘，芽MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA

烟草叶盘、叶柄MS+0.1mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA

pH 5.8，蔗糖30%，琼脂粉6.5g/L。

（二）灭菌

1．培养基及器具灭菌培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出已灭菌的培养基。

可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。

2．工作环境灭菌

接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。

3 . 植物材料的灭菌

植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。

植物材料的灭菌需在超净工作台内进行，可选择不同的灭菌剂进行植物组织表面消毒（见表3）。同时注意，表面消毒剂对植物组织也是有毒的。因此，应当选择消毒剂的浓度和时间，尽量减少组织的死亡。灭菌后，需用无菌水反复冲洗，彻底洗去表面消毒剂。

如：胡萝卜储藏根消毒：将胡萝卜用洗涤灵清洗，擦干，切段。进超净工作台后，先用75%酒精擦洗切段，擦干后，在2%次氯酸钠中浸泡5秒钟，用无菌水冲洗10 次，无菌滤纸吸干，用灭过菌的打孔器取材。准备工作就绪后，可以进行接种。

接种

1. 进台

工作人员进入接种室前，需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、手腕，再擦培养基瓶和超净工作台。

2. 接种

(1) 剪、镊消毒：接种前剪、镊应插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧，灼烧时应将剪口、镊口张开，烧至剪、镊上火焰熄灭为止，冷却后方可进行接种。接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时剪口并拢，不可接触磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。

(2) 插植外植体：左手拿三角瓶，解开封口膜，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。用右

手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基上，镊子灼烧后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，盖好封口膜，扎紧皮筋，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。

3 注意事项

(1) 操作人员的头、胳膊等不得进入台内；

(2) 操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染；

(3) 用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤手；

(4) 台外人员走动要轻、动作要小。

培养条件

接种或继代培养的植物组织置于人工气候箱中培养，每4-6周继代一次。培养过程如果有的培养物被微生物污染，应当马上将其清理，以免影响其它培养物。温度：对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合光：组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定的因素。渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。酸碱度：一般植物组织生长的最适宜pH为5～6．5。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。通气：悬浮培养中植物组织的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时经常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。接种或继代培养的植物组织置于人工气候箱中培养，温度25±2℃，适当光照强度和光周期。每4-6周继代一次。培养过程如果有的培养物被微生物污染，应当马上将其清理，以免影响其它培养物。

实验结果：愈伤组织培养数天后被微生物污染，有一块遇上组织较好，呈现乳白色，但周围有污染，失去传代价值。

结果分析：在胡萝卜组织清洗消毒或者是在接种时，没有严格操作，导致污染和试验的最终失败！