组织肉毒碱棕榈酰转移酶I活性比色法定量检测试剂盒产品说明

组织肉毒碱棕榈酰转移酶I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

组织肉毒碱棕榈酰转移酶I（CARNITINE PALMITOYL-TRANSFERASE I）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过肉碱和脂酰辅酶A以及特定抑制剂反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体等）肉毒碱棕榈酰转移酶I的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段。大于10个碳（C10）的活化型长链脂酰辅酶A是不能直接透过线粒体内膜，需要借助肉碱（camitine），即L-3羟-4-三甲基铵丁酸，而被转运入线粒体内，在线粒体内膜的外侧及内侧分别有肉碱脂酰转移酶（carnitine palmitoyl transferase；CPT；EC2.3.1.21）I和Ⅱ。位于内膜外侧的酶Ⅰ，促进脂酰CoA转化为脂酰肉碱，后者可借助线粒体内膜上的转位酶（或载体），转运到内膜内侧，然后，在酶Ⅱ催化下脂酰肉碱释放肉碱到胞浆，留下脂酰CoA。由此位于胞浆的活化脂肪酸―脂酰CoA穿过线粒体内膜进入基质而被氧化分解。肉碱脂酰转移酶缺失症导致机体无法代谢脂肪酸。基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A（malonyl CoA）存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶A（CoA-SH），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸

（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析丙二酰辅酶A敏感性肉碱脂酰转移酶I的特异活性。肉碱脂酰转移酶I反应系统为：

carnitine palmitoyl transferase I

camitine + palmitoyl-CoA →palmitoyl - camitine + CoA-SH

malonyl CoA（＋/－）

DTNB + CoA-SH →TNB + CoA-S-S-TNB

产品内容

清理液（Reagent A）60毫升

裂解液（Reagent B）10毫升

缓冲液（Reagent C）20毫升

反应液（Reagent D）1毫升

底物液（Reagent E）2毫升

抑制液（Reagent F）400微升

产品说明书1份

保存方式

保存缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、抑制液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和抑制液（Reagent F）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

台式离心机：用于样品操作

200微升1厘米光径光径比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备（总蛋白制备）

1．手术取出动物组织，并秤重500毫克

2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3．（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4．（选择步骤）抽去清理液

5．移入到一个液氮冻存管

6．即刻放进液氮罐过夜

7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）8．放进一个15毫升锥形离心管

9．加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B）

10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数4次（共15分钟），并置零

2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；缓冲液（Reagent C）室温下预热

三、样品总活性背景对照测定

1．移取215微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入25微升底物液（Reagent E）

3．在25℃温度下孵育3分钟

4．加入10微升待测样品（50微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

5．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

6．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

四、样品总活性测定

1．移取190微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入25微升反应液（Reagent D）

3．加入25微升底物液（Reagent E）

4．在25℃温度下孵育3分钟

5．加入10微升待测样品（50微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数（15分钟读数－0分钟读数）

五、样品非特异活性背景对照测定

1．移取205微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入25微升底物液（Reagent E）

3．加入10微升抑制液（Reagent F）

4．在25℃温度下孵育3分钟

5．加入10微升待测样品（50微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

六、样品非特异活性测定

检测开始前，分别移取10微升抑制液（Reagent F）和待测样品（注意：50微克总蛋白）到1.5毫升离心管里，混匀后，在25℃温度下孵育15分钟。然后继续下列操作。

1.移取180微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2.加入25微升反应液（Reagent D）

3.加入25微升底物液（Reagent E）

4.在25℃温度下孵育3分钟

5.加入20微升上述预处理的待测样品

6.上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7.即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数（15分钟读数－0分钟读数）

七、计算样品活性