抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法

1.水解度（DH ）的测定

采用OPA （邻苯二甲醛）法，取3.00 mLOPA 溶液于试管中加入400 μL 稀释至一定倍数的水解上清液，精确反应2 min 后在340 nm 处测定吸光值。同时以丝氨酸标准溶液（0.9516 mmol/L ）作参考和空白试验。

()

mmol/g

7.72tot h ）,

摩尔数（mmol/g 每克原料蛋白的肽键毫tot 数0.4和1表示；h 式中：β、α分别以常 (2) 100％tot h /αβ-2SerineNH DH 清液体积

N：稀释倍数；V：上含量；量；P：样品中的蛋白/g蛋白；X：样品重2serineNH ：mmol 2H 式中：SerineN (1) protein L/g P X V N mmol/L 0.9516空白式样

－OD 标准样品OD 空白式样OD 待测样品OD

2SerineNH =⨯=⨯⨯⨯⨯-=2.酶解产物的相对分子质量的分布

采用高效液相色谱法测定。取酶解液上清液稀释至一定浓度，微孔过滤膜过

滤后上色谱柱。

色谱条件：实验色谱柱：TSK gel 2000SWXL （300 mmx7.8 mm ），流动相：乙

腈：水：三氟乙酸=45:55:0.1（V/V/V ），检测波长220 nm ，流速0.5 mL/min ，柱温30℃，进样量10 μL 。

3.DPPH 清除能力测定

取一定浓度的样品溶液4 ml ，加入1 ml 用甲醇配制的DPPH 溶液，并使DPPH

终浓度为0.2 mmol/L 。用力振摇混匀后置暗室中静置30 min ，于517 nm 处测定吸光度。按照下式计算DPPH 清除率。

DPPH 清除率（％）=100*（1-（A2-A1）/A0），式中：A2是加入样品溶液后

的吸光度；A1是样品溶液本底的吸光度；A0是空白对照液的吸光度。

4.总还原能力测定

称取一定浓度的样品溶液2.5 mL ，加入0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.6）

和1％铁氰化钾溶液各2.5 mL ，混合均匀。混合液于50℃保温20 min 后。加入

2.5 mL 10％三氯乙酸，混匀，3000 r/min 离心10 min 。取上清液5 mL ，加5 mL 蒸馏水和1 mL 0.1％FeCl3，混合均匀，10 min 后于700 nm 处测定吸光度，以此作为总还原能力指标。

5.羟基自由基（•OH ）清除能力的测定

采用水杨酸法测定，利用H2O2 和Fe2﹢混合产生•OH ，在体系中加入水杨酸

捕捉•OH 显色。0.5 mL 的9.1 mmol 水杨酸乙醇溶液，0.5 mL 样品，0.5 mL 的

9.1 mmol FeSO4, 3.5 mL 蒸馏水，最后加入5 mL 8.8 mmol H2O2启动反应。涡

旋震荡，反应0.5 h后在510 nm处测定吸光值。

•OH自由基清除能力（%）= [（A0-A1）/A0] ×100%，式中A0为空白对照组，A1为样品反应后的吸光值。

6.O2-·清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法测定。取50 mmol/L Tris—HCl缓冲液(pH 8.2) 4.5 mL，置于25℃水浴中保温20 min，分别加入lmL样品溶液和0．4 mL, 25 mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入lmL 8 mmoFL HCI终止反应。于299 nm处测定吸光度似As。空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。每个试样做3个平行样，取平均值，按下式计算O2-·清除率。

O2-·清除率(％)=100x(Ao-As)/Ao，式中：Ao一空白对照液吸光度；As—样品溶液吸光度。