流式细胞仪培训ppt课件

• 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35
• NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94
• 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63
• 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97
• 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f
流式细胞仪
显微镜
流动的细胞
静止的细胞样本
数量大
数量少
高速分选
样本难以再利用
细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息
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流式细胞仪的主要特点
Ø 高速测定细胞，大样本计数 Ø 检测稀有细胞 Ø 多参数分析 Ø 自动化 Ø 细胞分选
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二、流式细胞仪工作原理
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流式细胞仪工作原理
流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过 聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被 荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射 光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和 光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通 过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被 计算机识别的数字信号，最后由计算机进行 计算处理。
645DL
600DL 550DL
488BK 488DL
流动室
High Sensitivity Quartz Flow Cell
Forward Scatter Detector
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激光配置
488nm氩离子激光器 633nm氦氖激光器 大功率水冷紫外激光器
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光路 - 滤片特性
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同
时也可以阻断并折射该波长以下的光 ，这种方式的滤片 称为二向色性滤片( dichroic filter)
630 nm BandPass Filter
White Light Source
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光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收并转化为电信号。
激光束
侧向散射光， 荧光
二色镜
1
2
细胞
前 向 散 射 光
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流式细胞术
（FLOW CYTOMETRY）
利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检 测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞 核）的物理、化学特性并通过这些特性对细 胞或颗粒进行定量。 u 检测表面标记物 u 检测胞浆标记物 u 检测胞核内标记物 u 检测可溶性蛋白
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流式细胞仪的基本结构
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特殊的显微镜
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原 理
u细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体 复合物。 u通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
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488nm空冷激光 ： FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、 PerCP 、EGFP 、EYFP 、AO 、TO 、Fluo3
慢性活动性肝 炎、肝硬化
肿瘤
降低
降低 降低
正常或 增高 增高
降低 降低 降低 降低
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用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原
表达该抗原的细胞被 标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧 光强度强
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阳性细胞百分 比或浓度
靶蛋白浓度
淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测
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仪器基本组成
流路
➢ 流动室 ➢ 鞘液SHEATH ➢ 样本流SAMPLE 单细胞悬液5105-1106个/ml
光路
➢ 光源 ➢ 滤片 ➢ 光电倍增管PMT HV
电路
➢ 放大电路HV及GAIN 增益 ➢ A/D转换
统计
➢ 计算机
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流路
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
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细胞免疫功能测定
• 淋巴细胞亚群 • 活化的T淋巴细胞 • 抗原特异性免疫细胞 • 调控性T细胞 • 树突状细胞 • 先天免疫细胞
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CD抗原及其相关细胞群
• 细胞群
CD抗原
• T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38
• B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75
主要内容
➢ 流式细胞仪概述 ➢ 流式细胞仪的工作原理 ➢ 流式细胞仪的应用 ➢ 检测的一般步骤
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一、流式细胞仪概述
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流式细胞仪种类
BD-Calibur
BD FACSVantage
Epics Altra
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Epics Altra B.eckman Coulter
流式细胞仪的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。
Focused laser beam
流 动 室
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流式细胞仪光路图
620BP FL3 (ECD)
575BP FL2 (PE)
525BP FL1 (FITC)
Air-cooled Argon Ion Laser
Side Scatter Detector
675BP FL4 (PC5)
Beam Shaping Lenses
• 内皮细胞 CD105 CD106 CD109
• 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126
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淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8
自身免疫病
降低 增高
CD4/ NK CD8 降低 降低
AIDS SARS
降低 降低
严重降 增高 低
降低 降低
降低 降低 降低
633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5
90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI …
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三、流式细胞仪应用
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流式细胞仪应用
Ø 淋巴细胞免疫功能测定 Ø 干细胞研究 Ø 细胞增殖与凋亡检测 Ø 细胞周期及倍体分析 Ø 细胞活性分析 Ø 细胞分选 Ø ……
收集透镜
光信号收集
3
带通滤波片 光电倍增管
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光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
数据处理
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换 （面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
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流式细胞仪产生的信号 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
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荧Hale Waihona Puke Baidu信号
FL1 – FITC,GFP…(PMT2) FL2 – PE (PMT3) FL3 – ECD,PI… (PMT4) FL4 – PC5,APC… (PMT5)