凝胶层析分离技术

凝胶层析加样操作示意图
1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加 到凝胶床面上，应避免将床面凝 胶冲起。 3-4、打开下口夹子，使样品 溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面 相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1mL 洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入3—4mL 洗脱液 于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收 集记录。
Ve：为实际测得的洗 脱容积，自样品加入 到组分最大浓度 (峰)出 现时所流出的容积；
Kd ? (Ve ? Vo ) Vi
0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化
四、有效分配系数（K eff ）
Kd ? (Ve ? Vo ) Vi
将Vt-Vo代替Vi，则：
Keff
?（Ve ? V0） （Vt ? V0）
聚
糖
凝
胶
部
分
结
构
(Sepha )
聚丙烯酰胺凝胶
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构
(Bio-Ge
)
琼脂琼脂糖糖凝凝胶胶(的Sep部ha分ros结e) 构 (Sepharose)
第二节 基 本 原 理
一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积 三、分配系数（Kd ） 四、有效分配系数（Kav ） 五、分子量与Ve 的关系
1、凝胶的处理
①将称好的干粉倾人过量的洗 脱液中，室温下充分溶胀。 注意不 要过分搅拌，以防颗粒破碎。 为了 缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热 溶胀3-5 小时，这样还可以杀死细 菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。
②为了保证流速稳定，获得较 好的实验结果，使用前用倾泻法倾 去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗 粒大小一致，。
第十章 凝胶层析法
第十章 凝胶层析法
第一节凝胶的条件和类型 第二节基本原理 第三节 凝胶层析的实验技术 第四节 凝胶层析的应用
第一节 凝胶的条件和类型
? 层析凝胶必须具备下列条件： ? 凝胶层析中常用凝胶类型
层析凝胶必须具备下列条件
1. 凝胶必须是化学惰性的 2. 凝胶的化学性质必须是稳定的 3. 凝胶上没有或只有极少量的离子基团 4. 凝胶必须具有足够的机械强度
1. 柱结构（φ、h）的选择 2. 装柱 3. 柱鉴定
柱结构（φ、h）的选择
三、样品上柱及洗脱
? 加样量的控制
分析：1-2ml/100ml 床体积 制备：10-30ml/100ml 床体积
? 洗脱液的选择
控制凝胶收缩
? 影响洗脱的因素
流速对蛋白质分辨率的影响 操作压与流速的关系
流速对蛋白质分辨率的影响
2柱、层柱析层析系系统统的的安组装装
3、凝胶装柱 。
①将层析柱垂直装载支架上， 将下端输液管夹紧；
②向柱中加入约1/3体积的0.9 ％NaCl溶液；
③将一细玻棒伸入柱内，靠近 管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内 加入混匀的凝胶溶液；
④凝胶加至层析柱顶端约3cm 时，打开柱下端输液开关，使流 速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。
五、 Ve与相对分子量的关系
Ve=K 1-K2lgM
K1、K2为常数，Ve可用如下表达 式代替，Ve-Vo （分离体积）， Ve/Vo （相对保留体积），Ve/Vt （简化洗脱体积），Keff （相对洗 脱体积）
在不同型号凝胶上蛋白质 的选择曲线的差异
第三节 凝胶层析的操作技术
一、凝胶的选择与处理 二、凝胶装拄制备 三、样品上柱及洗脱 四、实验操作 五、凝胶柱的保养和凝胶的保存
一、凝胶的选择
? 排阻范围与粒度的选择 ? 凝胶用量的计算
排阻范围的选择
粒度的选择
粒 度 的 选 择
凝胶用量的计算
干凝胶用量（ g）：πr 2h/ 膨胀度
（膨胀度： 床体积/克干胶）
理论用量×（ 1+10% ）凝胶的处理
Sephadex （中）湿球粒度 μm
吸水值 ml/g 干胶 床体积 ml/g 干胶 球蛋白分离范围 KD
一、凝胶的结构与分子筛效应
动画演示
二、凝胶床总体积
Vt ：柱床 “总容积”， Vo：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的 水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。 Vg：凝胶本身的容积；
Vt＝Vo十Vi十Vg 或 Vt-Vo = Vi 十Vg，
三、分配系数（Kd）
Ve＝Vo十KdVi
黏
黏度对分辨率的影响
度
对
分
辨
率
的
影
响
凝胶柱层析操作压
操作压与流速的关系
加样量对分辨率的影响
I .加养量少时，
A、B二种物质充全 分开。
II. 加养量适当
时，A、B 二种物 质刚刚分开。
III. 加养量太大
时，A、B二种物质 只能部分分开。
四、 凝胶层析的操作技术
1. 凝胶的处理 2. 柱层析系统的 安装 3. 凝胶装拄 4. 样品上柱及洗脱 5. Vo、Vi 、Vt 的测定 6. 标准曲线的制作及 Kd 和Kav 的计算 7. 凝胶柱的保养和凝胶的 保存
④连续而缓慢的加凝胶直到稳 定在离管口约5cm处。
（防止空气进入凝胶床）
4、样品上柱及洗脱
①加样量的控制
分析：1-2ml/100ml 床体积， 制备：10-30ml/100ml 床体积
②洗脱液的选择： 洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶
液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而 影响分离效果。
③凝胶层析加样 操作示意图 ④洗脱与自动收集 记录 ⑤凝胶柱层析 实物连接 ⑥凝胶层析中的 分离行为
凝胶层析中常用凝胶
葡聚糖凝胶 (dextran gel ，Sephadex ) 聚丙烯酰胺凝胶 (polyacrylamide gel ，Bio-Gel P ) 琼脂糖凝胶 (agarose gel ，Sepharose ) 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶 (Superdex )
葡
葡聚糖凝胶部分结构
即：Ve＝Vo十K eff(Vt-Vo)
实际上， Keff是将以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固 定相，而洗脱剂(Ve-Vo为) 流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小， 而对交联度大的凝胶差别大。
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在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后， 所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，
G-25 G-75
100200
2.5 ±0. 2
4-6
120200
7.5 ±0. 5
12-15
1-5
3-80
G100 G-150
20200
10.0 ±1 .0
15-20
120200
15.0 ±1. 5
20-30
4-150 5-300
G-200
120200
20.0 ±2 .0
30-40
5-600
二、凝胶装拄制备