微生物限度检查法操作规程
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稀释 10 －1 10 －2 10 －3 菌落数 10 12 2 3 1 3 平均值 11 报告 11×10 ＝110
如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均落数小 于1小时，应报告菌数为<1×稀释倍数个/g或ml。
结果报告 ① 菌落数在100以内时，按实有数报告。
② 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第 三位按数值修约规则处理。
微生物限度检查法操作规 程
质量检测中心 张廷滔
定义
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅 料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉 菌数、酵母菌数及控制菌检查。
• 本检查法中细菌及控制菌培养温度为 30℃～35℃；霉菌、 酵母菌培养温度为 23℃～28℃。 • 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告， 特殊品种可以最小包装单位报告。
细菌和控制菌检查
• 薄膜过滤法
• 制备平皿 • 准备2个无菌平皿，倾注营养琼脂培养基约1520ml，半盖盖，除出去冷凝水后，盖上平皿盖待 凝。
• 火焰喷射器在检验仪的过滤头表面灭菌3～5秒钟。 • 镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住3张无菌滤膜放置在3个过 滤头中央。 • 将已经过灭菌的过滤杯小心安装在过滤头上。从过滤杯的 上边缘按下过滤杯卡在过滤头上。
实验前的准备
• 以头孢氨苄胶囊为例 • 1.在《洁净室使用记录上》登记好头孢氨苄胶囊的规格、
批号；准备一张微生物限度检查空白记录，填好除检验结 果以及温湿度外的其他必要信息。
• 2.准备好相应的检查用品：
– 营养琼脂培养基和玫瑰红纳琼脂培养基各1瓶融化后，放入烤箱中待 用 – 100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 1瓶 – 9ml/管的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4支 – 0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） – 滤杯 – 沉降菌平皿 – 空白平皿 -吸管、镊子、剪刀等放入不锈钢盒中经干热灭菌后待用
• 一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计， 以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层 内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵 母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等 的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取 可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间4～7天， 细菌菌落常会生长增大而加以区别。
稀释 10 －1 10 －2 10 －3
菌落数 280 260 29 28 3 2
平均值 270
报告 270×10＝2700
• 当有2个或2个以上稀释级的菌落数符合上述规定 时，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告。
Leabharlann Baidu
如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数 乘以稀释倍数报告。
消毒液 空白对照
供试液的制备原则
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜 的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和 剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生 物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温 度不应超过45℃，时间不得超过30min
常用的供试品制备方法
• 液体供试品
– 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 至100ml，混匀，作为1：10的供试液。水溶性液体 制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
菌落计数
• 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2 个菌落或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌 落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现 性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生 长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数 用。
菌落报告原则
• 如只有1个稀释级平均菌落数在30—300（30--100）之间，则 将该稀释级的菌落乘以稀释倍数报告。
10-1
10-2
10-3
• 在上述进行10倍递增 稀释的同时，以该稀 释级吸管，吸取该级 稀释液各1ml至2个灭 菌平皿中，（一般为 左手持平皿，将盖半 开，右手持吸管）， 注入平皿时，将1ml 供试液慢慢全部注入 平皿中，管内无残留 液体，防止反流到吸 管尖端部。
• 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支吸管 吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲 液）各1ml，分别注入2个平皿中
• 在供试液静止沉淀的同时准备8个无菌平皿，每2皿 为一组，分别在每组的2个平皿盖上分别依次注明 “0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。 • 准备3瓶胆盐乳糖培养基，分别在瓶上注明”1-/2, 1+/2, 0/2",其中2标示当月2号，1表示当天所做的第 一个样品、+：表示样品阳性，-：表示样品、0：表 示阴性对照。
在安装滤杯的时候，手不要接 触滤杯的内部
• 预润滤膜
– 将事先插在75%酒精棉球中的剪刀过火焰数次后，撬 去冲洗液瓶子的铝塑盖和胶塞，将瓶口和瓶颈部位过 火焰数次。 – 向3个过滤杯中，分别加入少量的0.1%无菌蛋白胨水 溶液，顺时针旋转阀门手柄90度，打开过滤头对应阀 门。按下检验仪的启停开关启动仪器过滤。
• 在二更更鞋，然后戴上绸帽，绸帽应包裹住全部头发；再 戴上口罩，口罩必须覆盖嘴、鼻，在脑后勒紧；最后穿洁 净区连体工作服，依次将左脚、右脚、左手、右手穿入 （过程中应避免碰触洁净衣外表面，同时洁净衣也不得接 触地面或墙面）→检查自己的着装→用手肘开门进入C级 缓冲间。 • 在C级缓冲间，用手肘开门分别进入C级微生物限度检查 室一和检查室二，带上无菌手套，再在消毒液中浸泡约30 秒。
• 3.配置消毒液
– 0.1%洁尔灭溶液 – 75%乙醇
4.将待检样品以及的相关用品（包括培养基、
物料
注：进入无菌检验
室的样品若有两层 包装的，需将外包 装在传递窗或缓冲 间拆除后，经传递 窗传入实验室。
缓冲液以及检测用器皿等），经传递窗紫外消毒60分钟后， 再转运至微生物限度检查室。
微生物限度 传递窗 检查室
• 5.按空调机组上的"F2”键，开启空调；通
过物流通道处的按钮，开启净化工作台。
化验人员按照《进出微生物检测室更衣 操作规程》进行正确的更衣。
• 进入更鞋室→更鞋→脱去工作服及私人衣物（只剩贴身内 衣、内裤）挂在衣钩上→并将所有头发塞入发网中固定→ 洗手→用手肘开门进入一更。
• 然后取GEL溶液2～3ml，采用六步法对双手和手腕进行消 毒（在30秒内保持双手完全被GEL覆盖）→用手肘开门进 入C级二更（黄色地面）。
③ 复试 供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中 任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品， 依法作单项复试两份，以三次检验结果的平均值报 告。
异常情况处理
菌落蔓延 1.加TTC（1000ml营养琼脂加1％的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑琼 脂 )1ml ) 2.开盖干燥（将已凝固的营养琼脂平板开盖，倒置倾放于净化 工作台上，开机1-2h合盖，在倒置于培养箱内） 异常菌落数报告法 细菌平皿上长霉菌、霉菌平皿上长细菌，哪个多，以哪个计 数，不能相加计数。
• 检查环境
• 微生物限度检查环境在洁净度C级下的局部洁 净度B级的单向流空气区域内进行。
微生物限度检查室
• 要求
• 温度：18～26℃； • 相对湿度：45～65 ％； • 压差：洁净室与外 界压差≥30Pa
• 培养基
– 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 – 胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养 基、 – 曙红亚甲蓝琼脂培养基、营养肉汤培养基、四 硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基
过滤样品
– 分别取10ml上清液（取相当于1g供试品），分别加入3 个滤杯中过滤或先将10ml上清液加入100ml0.1%无菌 蛋白胨水中混匀，再过滤。
冲洗
– 用800ml0.1%无菌蛋白胨水分次冲洗过滤，每次约 100ml，总冲洗量不得超过1000ml。
每次冲洗时冲洗液瓶的瓶口和瓶颈部位应过火焰数次， 在过滤前后，应保持滤膜的完整性。
倾注培养基
右手拿装有培 养基的锥形瓶， 左手拨出棉塞。 右手拿锥形瓶，使瓶口 迅速通过火焰。
用左手的拇指和食指将培养皿打开 一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶 中玫瑰红琼脂培养基倒入培养皿， 以顺时针或反时针方向快速旋转平皿
半盖盖，除出去冷凝水后， 盖上平皿盖至操作台上待凝
注：混匀时 切勿将培养 基溅到皿边 及皿盖上
• 化验人员用浸泡了消毒液的无菌毛巾，擦拭净化 工作台台面。
• 打开传递窗，将相关的检查用品依次摆放在不锈 钢桌上和净化工作台上。（镊子和剪刀应插入 75%酒精棉球中）
• 准备7个沉降菌平皿，做 好标记和日期
净化工作台 检查室地面
2个 2个 1个 1个 1个
• 在净化工作台上和检查室 地面上摆放好沉降菌平皿。 操作者手指 • 用消毒液清洗浸泡双手， 将消毒毛巾贴好，放在净 化工作台台面上。
操作前
操作结束后
清洁和消毒 频率
每周 每天
菌落报告原则
• 细菌数选取平均菌落数在30—300之间的稀释级。
• 霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30—100之间 的稀释级。
因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌 分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。
菌落计数
• 取10mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加入100ml胆 盐乳糖培养基中作为阴性对照。
• 再用火焰喷射器在灭菌检验仪的过滤头 • 镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住1张无菌滤膜放置在1个过 滤头中央。 • 安装过滤杯 • 用少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，过滤。 • 取出滤膜，贴于培养基平板上做为阴性对照。
• 样品过滤完后，逆时针旋转阀门手柄90度，关闭过滤头对 应阀门，然后按启停开关停止仪器。 • 镊子在火焰上灭菌并冷却取出第一张滤膜，菌面朝上贴于 制备好的培养基平板上。（滤膜贴于平板上时不得有空隙 或气泡，否则影响微生物生长）。
• 镊子再次火焰上灭菌并冷却分别取出第二张和第三张滤膜， 快速接至100ml胆盐乳糖培养基中，分别做为样品和样品 阳性。
• 固体、半固体或粘稠液供试品
– 称取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1： 10供试液。有必要时可适当加温（不应超过45℃）。
供试液的制备
取10g头孢氨苄胶囊于磨口瓶中，用无菌剪刀将其剪碎， 加入100mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液混匀，作为1： 10供试液。静止得上清液备用。
酵母菌和霉菌的检查平皿法
样品的稀释
每递增l稀释级，必须另换一支吸管。 稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm， 反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许， 然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第 2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部 供试液（吸管内应无黏附或残留液体）
培养
• 将冷凝后的平板用保 鲜膜包裹好，注明检 查日期。 • 倒置培养，细菌平板 于30～35℃培养箱中 培养3天。霉菌、酵母 菌计数平板于23～ 28℃培养箱中培养5天。 逐日观察菌落生长情 况，点计菌落数。
• 完成微生物限度检查后，将待培养的样品、废弃 物等通过传递窗传出。 • 检查人员对洁净室进行清洁。
• 稀释液和冲洗液 – 0.1%蛋白胨水溶液 – pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 – 0.9%氯化钠溶液
供试品的保存
• 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿 冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件 不妥引起致死或繁殖。
• 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁 开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
注意事项
1．供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用 具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口 吹吸。 2．从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在 1小时内完成， 避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。
3．供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，以免造成实验误 差。
4．在净化工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台
如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均落数小 于1小时，应报告菌数为<1×稀释倍数个/g或ml。
结果报告 ① 菌落数在100以内时，按实有数报告。
② 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第 三位按数值修约规则处理。
微生物限度检查法操作规 程
质量检测中心 张廷滔
定义
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅 料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉 菌数、酵母菌数及控制菌检查。
• 本检查法中细菌及控制菌培养温度为 30℃～35℃；霉菌、 酵母菌培养温度为 23℃～28℃。 • 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告， 特殊品种可以最小包装单位报告。
细菌和控制菌检查
• 薄膜过滤法
• 制备平皿 • 准备2个无菌平皿，倾注营养琼脂培养基约1520ml，半盖盖，除出去冷凝水后，盖上平皿盖待 凝。
• 火焰喷射器在检验仪的过滤头表面灭菌3～5秒钟。 • 镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住3张无菌滤膜放置在3个过 滤头中央。 • 将已经过灭菌的过滤杯小心安装在过滤头上。从过滤杯的 上边缘按下过滤杯卡在过滤头上。
实验前的准备
• 以头孢氨苄胶囊为例 • 1.在《洁净室使用记录上》登记好头孢氨苄胶囊的规格、
批号；准备一张微生物限度检查空白记录，填好除检验结 果以及温湿度外的其他必要信息。
• 2.准备好相应的检查用品：
– 营养琼脂培养基和玫瑰红纳琼脂培养基各1瓶融化后，放入烤箱中待 用 – 100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 1瓶 – 9ml/管的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4支 – 0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） – 滤杯 – 沉降菌平皿 – 空白平皿 -吸管、镊子、剪刀等放入不锈钢盒中经干热灭菌后待用
• 一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计， 以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层 内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵 母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等 的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取 可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间4～7天， 细菌菌落常会生长增大而加以区别。
稀释 10 －1 10 －2 10 －3
菌落数 280 260 29 28 3 2
平均值 270
报告 270×10＝2700
• 当有2个或2个以上稀释级的菌落数符合上述规定 时，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告。
Leabharlann Baidu
如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数 乘以稀释倍数报告。
消毒液 空白对照
供试液的制备原则
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜 的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和 剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生 物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温 度不应超过45℃，时间不得超过30min
常用的供试品制备方法
• 液体供试品
– 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 至100ml，混匀，作为1：10的供试液。水溶性液体 制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
菌落计数
• 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2 个菌落或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌 落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现 性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生 长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数 用。
菌落报告原则
• 如只有1个稀释级平均菌落数在30—300（30--100）之间，则 将该稀释级的菌落乘以稀释倍数报告。
10-1
10-2
10-3
• 在上述进行10倍递增 稀释的同时，以该稀 释级吸管，吸取该级 稀释液各1ml至2个灭 菌平皿中，（一般为 左手持平皿，将盖半 开，右手持吸管）， 注入平皿时，将1ml 供试液慢慢全部注入 平皿中，管内无残留 液体，防止反流到吸 管尖端部。
• 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支吸管 吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲 液）各1ml，分别注入2个平皿中
• 在供试液静止沉淀的同时准备8个无菌平皿，每2皿 为一组，分别在每组的2个平皿盖上分别依次注明 “0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。 • 准备3瓶胆盐乳糖培养基，分别在瓶上注明”1-/2, 1+/2, 0/2",其中2标示当月2号，1表示当天所做的第 一个样品、+：表示样品阳性，-：表示样品、0：表 示阴性对照。
在安装滤杯的时候，手不要接 触滤杯的内部
• 预润滤膜
– 将事先插在75%酒精棉球中的剪刀过火焰数次后，撬 去冲洗液瓶子的铝塑盖和胶塞，将瓶口和瓶颈部位过 火焰数次。 – 向3个过滤杯中，分别加入少量的0.1%无菌蛋白胨水 溶液，顺时针旋转阀门手柄90度，打开过滤头对应阀 门。按下检验仪的启停开关启动仪器过滤。
• 在二更更鞋，然后戴上绸帽，绸帽应包裹住全部头发；再 戴上口罩，口罩必须覆盖嘴、鼻，在脑后勒紧；最后穿洁 净区连体工作服，依次将左脚、右脚、左手、右手穿入 （过程中应避免碰触洁净衣外表面，同时洁净衣也不得接 触地面或墙面）→检查自己的着装→用手肘开门进入C级 缓冲间。 • 在C级缓冲间，用手肘开门分别进入C级微生物限度检查 室一和检查室二，带上无菌手套，再在消毒液中浸泡约30 秒。
• 3.配置消毒液
– 0.1%洁尔灭溶液 – 75%乙醇
4.将待检样品以及的相关用品（包括培养基、
物料
注：进入无菌检验
室的样品若有两层 包装的，需将外包 装在传递窗或缓冲 间拆除后，经传递 窗传入实验室。
缓冲液以及检测用器皿等），经传递窗紫外消毒60分钟后， 再转运至微生物限度检查室。
微生物限度 传递窗 检查室
• 5.按空调机组上的"F2”键，开启空调；通
过物流通道处的按钮，开启净化工作台。
化验人员按照《进出微生物检测室更衣 操作规程》进行正确的更衣。
• 进入更鞋室→更鞋→脱去工作服及私人衣物（只剩贴身内 衣、内裤）挂在衣钩上→并将所有头发塞入发网中固定→ 洗手→用手肘开门进入一更。
• 然后取GEL溶液2～3ml，采用六步法对双手和手腕进行消 毒（在30秒内保持双手完全被GEL覆盖）→用手肘开门进 入C级二更（黄色地面）。
③ 复试 供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中 任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品， 依法作单项复试两份，以三次检验结果的平均值报 告。
异常情况处理
菌落蔓延 1.加TTC（1000ml营养琼脂加1％的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑琼 脂 )1ml ) 2.开盖干燥（将已凝固的营养琼脂平板开盖，倒置倾放于净化 工作台上，开机1-2h合盖，在倒置于培养箱内） 异常菌落数报告法 细菌平皿上长霉菌、霉菌平皿上长细菌，哪个多，以哪个计 数，不能相加计数。
• 检查环境
• 微生物限度检查环境在洁净度C级下的局部洁 净度B级的单向流空气区域内进行。
微生物限度检查室
• 要求
• 温度：18～26℃； • 相对湿度：45～65 ％； • 压差：洁净室与外 界压差≥30Pa
• 培养基
– 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 – 胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养 基、 – 曙红亚甲蓝琼脂培养基、营养肉汤培养基、四 硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基
过滤样品
– 分别取10ml上清液（取相当于1g供试品），分别加入3 个滤杯中过滤或先将10ml上清液加入100ml0.1%无菌 蛋白胨水中混匀，再过滤。
冲洗
– 用800ml0.1%无菌蛋白胨水分次冲洗过滤，每次约 100ml，总冲洗量不得超过1000ml。
每次冲洗时冲洗液瓶的瓶口和瓶颈部位应过火焰数次， 在过滤前后，应保持滤膜的完整性。
倾注培养基
右手拿装有培 养基的锥形瓶， 左手拨出棉塞。 右手拿锥形瓶，使瓶口 迅速通过火焰。
用左手的拇指和食指将培养皿打开 一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶 中玫瑰红琼脂培养基倒入培养皿， 以顺时针或反时针方向快速旋转平皿
半盖盖，除出去冷凝水后， 盖上平皿盖至操作台上待凝
注：混匀时 切勿将培养 基溅到皿边 及皿盖上
• 化验人员用浸泡了消毒液的无菌毛巾，擦拭净化 工作台台面。
• 打开传递窗，将相关的检查用品依次摆放在不锈 钢桌上和净化工作台上。（镊子和剪刀应插入 75%酒精棉球中）
• 准备7个沉降菌平皿，做 好标记和日期
净化工作台 检查室地面
2个 2个 1个 1个 1个
• 在净化工作台上和检查室 地面上摆放好沉降菌平皿。 操作者手指 • 用消毒液清洗浸泡双手， 将消毒毛巾贴好，放在净 化工作台台面上。
操作前
操作结束后
清洁和消毒 频率
每周 每天
菌落报告原则
• 细菌数选取平均菌落数在30—300之间的稀释级。
• 霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30—100之间 的稀释级。
因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌 分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。
菌落计数
• 取10mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加入100ml胆 盐乳糖培养基中作为阴性对照。
• 再用火焰喷射器在灭菌检验仪的过滤头 • 镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住1张无菌滤膜放置在1个过 滤头中央。 • 安装过滤杯 • 用少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，过滤。 • 取出滤膜，贴于培养基平板上做为阴性对照。
• 样品过滤完后，逆时针旋转阀门手柄90度，关闭过滤头对 应阀门，然后按启停开关停止仪器。 • 镊子在火焰上灭菌并冷却取出第一张滤膜，菌面朝上贴于 制备好的培养基平板上。（滤膜贴于平板上时不得有空隙 或气泡，否则影响微生物生长）。
• 镊子再次火焰上灭菌并冷却分别取出第二张和第三张滤膜， 快速接至100ml胆盐乳糖培养基中，分别做为样品和样品 阳性。
• 固体、半固体或粘稠液供试品
– 称取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1： 10供试液。有必要时可适当加温（不应超过45℃）。
供试液的制备
取10g头孢氨苄胶囊于磨口瓶中，用无菌剪刀将其剪碎， 加入100mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液混匀，作为1： 10供试液。静止得上清液备用。
酵母菌和霉菌的检查平皿法
样品的稀释
每递增l稀释级，必须另换一支吸管。 稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm， 反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许， 然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第 2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部 供试液（吸管内应无黏附或残留液体）
培养
• 将冷凝后的平板用保 鲜膜包裹好，注明检 查日期。 • 倒置培养，细菌平板 于30～35℃培养箱中 培养3天。霉菌、酵母 菌计数平板于23～ 28℃培养箱中培养5天。 逐日观察菌落生长情 况，点计菌落数。
• 完成微生物限度检查后，将待培养的样品、废弃 物等通过传递窗传出。 • 检查人员对洁净室进行清洁。
• 稀释液和冲洗液 – 0.1%蛋白胨水溶液 – pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 – 0.9%氯化钠溶液
供试品的保存
• 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿 冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件 不妥引起致死或繁殖。
• 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁 开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
注意事项
1．供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用 具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口 吹吸。 2．从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在 1小时内完成， 避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。
3．供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，以免造成实验误 差。
4．在净化工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台