第8章 酶分子的化学修饰
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肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下 与酶分子共价结合。
常见的修饰方法
溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠 氮法、琥珀酸酐法和三氯均嗪法等。
1 聚乙二醇修饰酶
• 分子量在500-20,000范围内 • 是既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机 溶剂的两亲分子 • 没有免疫原性和毒性 • 生物相容性已经通过美国FDA认证 修饰方法：三氯均嗪法和琥珀酸酐法
过程：大分子活化>>>> 与酶共价结合 例：
3 具有生物活性的大分子
由二种多糖交替连接而成的酸性黏多糖
抗凝血、抗血栓和降血脂等生物学活性 活化方法：溴化氢
4 蛋白质或其它大分子物质修饰酶 • 血浆蛋白质是血浆中的天然成分，与其 它蛋白在血液中的复合物在血液中被视 为“自身蛋白”。
• 其中人血清白蛋白是目前研究较多的一 种重要的酶修饰剂。 • 修饰方法：戊二醛法，羰二亚胺法等。
+ ICH2COOH + HI
5)胍基的化学修饰
来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：
丁二酮
二羰基化合物
1，2－环己二酮
苯乙二醛
6）吲哚基的化学修饰
来源：Trp
修饰反应：氧化反应
修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺（NBS)
侧链基团修饰
几种重要的修饰反应
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰
2 右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 • 由多个-葡萄糖通过-1,6-糖苷键形成的 多糖 • 具有较好的水溶性和生物相溶性 • 可用作代血浆 • 修饰方法主要有溴化氰法和高碘酸氧化法 等。
• 血浆代用品(Plasma substitute)是一种分子量接近 血浆白蛋白的胶体溶液，输入血管后依赖其胶体渗透 压而起到代替和扩张血容量的作用，在治疗失血性休 克时可节约部分全血。
接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破
坏。
2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减
少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成
了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
• 酶的化学修饰（chemical modification）
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共 价结构发生改变。 • 广义：凡涉及共价或部分共价键的形成或 破坏，从而改变酶学性质均可看作是酶分 子的化学修饰。 • 酶选择性化学修饰：在较温和的条件下， 以可以控制的方式使一种蛋白质同某些化 学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸 残基或其功能基发生共价的化学改变。
一、 化学修饰剂
二、 几种重要的修饰反应
三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
化学修饰剂
常用有顺丁烯二酸酐，可逆修饰氨基，形成化合物在 酸性中不稳定。 对酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基反应，但在弱碱下可 被水解。
巯基可以形成稳定的化合物。
亲核性是指：带负电荷或孤对电子的试剂即亲核试剂对亲电子 原子的进攻的能力。
五、 测定修饰程度和修饰部位
修饰反应的评价因素
1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上 2、 哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少
3、 有多少种不同形式的修饰剂－酶分子耦合物， 每种各有多少
8.3 肽链有限水解修饰
肽链有限水解修饰
• 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结
构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性
试剂：乙酰咪唑/二异丙基磷酰氟/硫代三氟乙 酸乙酯
可 作 用 基 团 ： 氨 基 ， 巯 基 ， 醇 羟 基 （ Ser 、 Thr），酚羟基（Tyr）
酰基化反应
2) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）
•E－SH ＋
2) 氨基的化学修饰：
来源：Lys, Arg, His, Gln
修饰反应：甲基化、酰基化与烷基化
酰基化修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）
烷基化修饰剂：
碘乙酸、Leabharlann Baidu乙酰胺、芳族磺酸等
3) 羧基的化学修饰
常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。
• 应用实例：
1）酶原激活 a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
2）提高酶活力：
天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个 氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。
二、 几种重要的修饰反应
酰化及其相关反应
烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 酰基化反应
最早在烟草花叶病毒的外壳蛋白N-末端发
乙酰化。
生物界普遍存在。
N-乙酰转移酶
甘氨酸/丙氨酸/丝氨酸/甲硫氨酸/天冬氨酸
1. 化学修饰反应的类型
试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。
酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。
8.5 大分子结合修饰
大分子修饰（大分子结合修饰）
是目前应用最广的酶分子修饰方法。
1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶
的空间结构发生某些精细的改变，从而改变 酶的特性与功能的方法。
•
• •
提高酶的活力 增加酶的稳定性 降低或消除抗原性
2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、
酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。
酶的活性中心的存在就是通过酶化学修饰来证实的
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。 1）提高酶的生物活性（酶活力）
1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合后酶活力提高30%
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）
治疗血栓有显著疗效的尿激酶在体内的半衰期只有2～20min,用PEG、右旋糖 酐修饰后，血液中的半衰期从6min提高到35h。
8.6 亲和标记
• 亲和标记是根据酶和底物的亲和性，修饰剂不 仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被 作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位 的某一基团,而不与被作用部位以外的同类基 团发生作用。
• 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。
• 亲和标记设计要满足两个条件：
1 亲和试剂应当对活性部位专一性结合 2 亲和试剂必须含有能与某些氨基酸残基起 反应的化学基团 蛋白质的正常配位体、底物和抑制剂的结 构都可以作为设计亲和试剂的参考。
第8章 酶分子的化学修饰
酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因：
1)细胞外稳定性差；
2)反应条件严苛； 3)具有抗原性。
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子化学修饰的方法来改变已分 离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
3）消除抗原性。
4）产生新的催化能力。
8.1 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个活性反应基团， 可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产 生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
的活性部位。
酶抑制剂是通过作用于酶活性部位来降低酶催化能力的。
酶共价交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间 障碍阻挡抑制剂，“遮盖”酶活性部位，增强了酶抗抑制 剂能力。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解
酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶
和功能的方法。
• 酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋
白酶或肽酶为修饰剂）。
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种： • 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 • 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 • 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部 位，酶活力提高。
利用肽链的水解，可以使酶的空间结构发生某 些精细的变化，从而改变酶的特性和功能的方法， 称为肽链的有限水解修饰。
一、充分认识酶分子的特性
1. 活性部位情况
2. 稳定条件及反应最佳条件
（热稳定性、pH稳定性、最适pH、温度）
3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择
1）首先要与氨基酸反应残基发生化学反 应，形成紧密的共价链接。 2）与某一特定的氨基酸残基侧链基团特 异反应。
三、反应条件的选择
允许修饰能顺利进行；不造成蛋白质的不可逆变性；有利于
可定量测定酶分子中羧基的数目。
+
碳化二亚胺
酶-碳二亚胺衍生物
•硼氟化三甲烊盐和甲醇-HCl反应生成甲酯
4)咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂:
常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
+
修饰酶（240nm)
+ C2H5OH +CO2
烷基化修饰剂：碘乙酸
专一性修饰蛋白。
1. 酶与修饰剂的分子比例
2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件
3. 反应温度及时间
四、 修饰反应的一般程序
注意事项
修饰后需进行总的氨基酸分析
各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基
进行确定
注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和
修饰程度及对酶活性的影响
修饰后酶性质的改变
特定氨基酸残基侧链 基团的化学修饰
羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰
二硫键的化学修饰
（三）交联修饰（交联法）
用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不
同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。
（四）固定化修饰（共价偶联法）
通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接
到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺等。
烷基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。
氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
还原剂：巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）等。
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、
咪唑基，酚基等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关）
木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其 肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大 降低。
8.4 分子侧链基团修饰
侧链基团修饰
采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的 侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和 功能的修饰方法
酶侧链基团
组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨 基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、 羟基、胍基、甲硫基等
五、改变酶学性质
绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度并没有发生改
变。
但是有些酶在修饰后，米氏常数Km会增大。
空间障碍影响酶与底物的结合。
抵挡各种失活因子能力增强和体内半衰期的延长。
8.2 酶分子化学修饰的方法学
方法很多，充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特征，或
直接或间接与酶分子上的某种氨基酸残基进行化学反应。
作用
研究各基团的作用及其对酶的结构、特性和
功能的影响 (研究酶活性中心的必需基团)
改变酶分子性质，提高实用价值
测定某一基团在酶分子中的数量
获得新酶种
类别
蛋白类酶 核酸类酶
侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶 碱基上的氨基和羟基(酮基)等
8.4 分子侧链基团修饰
光亲和试剂
• 是一类特殊的亲和试剂 • 它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外 ，还具有一个光反应基团。 • 先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结 合，然后被光照激活后，产生一个活泼的 功能基团，能与它们附近基团反应，形成 一个共价的标记物。
4) 芳香环取代反应
试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代： I2＋
硝化：
+ HI
(NO2)4C +
（四硝基甲烷）
+(NO2)3CH
2. 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1)巯基的化学修饰
来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
常见的修饰方法
溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠 氮法、琥珀酸酐法和三氯均嗪法等。
1 聚乙二醇修饰酶
• 分子量在500-20,000范围内 • 是既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机 溶剂的两亲分子 • 没有免疫原性和毒性 • 生物相容性已经通过美国FDA认证 修饰方法：三氯均嗪法和琥珀酸酐法
过程：大分子活化>>>> 与酶共价结合 例：
3 具有生物活性的大分子
由二种多糖交替连接而成的酸性黏多糖
抗凝血、抗血栓和降血脂等生物学活性 活化方法：溴化氢
4 蛋白质或其它大分子物质修饰酶 • 血浆蛋白质是血浆中的天然成分，与其 它蛋白在血液中的复合物在血液中被视 为“自身蛋白”。
• 其中人血清白蛋白是目前研究较多的一 种重要的酶修饰剂。 • 修饰方法：戊二醛法，羰二亚胺法等。
+ ICH2COOH + HI
5)胍基的化学修饰
来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：
丁二酮
二羰基化合物
1，2－环己二酮
苯乙二醛
6）吲哚基的化学修饰
来源：Trp
修饰反应：氧化反应
修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺（NBS)
侧链基团修饰
几种重要的修饰反应
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰
2 右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 • 由多个-葡萄糖通过-1,6-糖苷键形成的 多糖 • 具有较好的水溶性和生物相溶性 • 可用作代血浆 • 修饰方法主要有溴化氰法和高碘酸氧化法 等。
• 血浆代用品(Plasma substitute)是一种分子量接近 血浆白蛋白的胶体溶液，输入血管后依赖其胶体渗透 压而起到代替和扩张血容量的作用，在治疗失血性休 克时可节约部分全血。
接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破
坏。
2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减
少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成
了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
• 酶的化学修饰（chemical modification）
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共 价结构发生改变。 • 广义：凡涉及共价或部分共价键的形成或 破坏，从而改变酶学性质均可看作是酶分 子的化学修饰。 • 酶选择性化学修饰：在较温和的条件下， 以可以控制的方式使一种蛋白质同某些化 学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸 残基或其功能基发生共价的化学改变。
一、 化学修饰剂
二、 几种重要的修饰反应
三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
化学修饰剂
常用有顺丁烯二酸酐，可逆修饰氨基，形成化合物在 酸性中不稳定。 对酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基反应，但在弱碱下可 被水解。
巯基可以形成稳定的化合物。
亲核性是指：带负电荷或孤对电子的试剂即亲核试剂对亲电子 原子的进攻的能力。
五、 测定修饰程度和修饰部位
修饰反应的评价因素
1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上 2、 哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少
3、 有多少种不同形式的修饰剂－酶分子耦合物， 每种各有多少
8.3 肽链有限水解修饰
肽链有限水解修饰
• 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结
构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性
试剂：乙酰咪唑/二异丙基磷酰氟/硫代三氟乙 酸乙酯
可 作 用 基 团 ： 氨 基 ， 巯 基 ， 醇 羟 基 （ Ser 、 Thr），酚羟基（Tyr）
酰基化反应
2) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）
•E－SH ＋
2) 氨基的化学修饰：
来源：Lys, Arg, His, Gln
修饰反应：甲基化、酰基化与烷基化
酰基化修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）
烷基化修饰剂：
碘乙酸、Leabharlann Baidu乙酰胺、芳族磺酸等
3) 羧基的化学修饰
常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。
• 应用实例：
1）酶原激活 a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
2）提高酶活力：
天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个 氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。
二、 几种重要的修饰反应
酰化及其相关反应
烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 酰基化反应
最早在烟草花叶病毒的外壳蛋白N-末端发
乙酰化。
生物界普遍存在。
N-乙酰转移酶
甘氨酸/丙氨酸/丝氨酸/甲硫氨酸/天冬氨酸
1. 化学修饰反应的类型
试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。
酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。
8.5 大分子结合修饰
大分子修饰（大分子结合修饰）
是目前应用最广的酶分子修饰方法。
1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶
的空间结构发生某些精细的改变，从而改变 酶的特性与功能的方法。
•
• •
提高酶的活力 增加酶的稳定性 降低或消除抗原性
2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、
酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。
酶的活性中心的存在就是通过酶化学修饰来证实的
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。 1）提高酶的生物活性（酶活力）
1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合后酶活力提高30%
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）
治疗血栓有显著疗效的尿激酶在体内的半衰期只有2～20min,用PEG、右旋糖 酐修饰后，血液中的半衰期从6min提高到35h。
8.6 亲和标记
• 亲和标记是根据酶和底物的亲和性，修饰剂不 仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被 作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位 的某一基团,而不与被作用部位以外的同类基 团发生作用。
• 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。
• 亲和标记设计要满足两个条件：
1 亲和试剂应当对活性部位专一性结合 2 亲和试剂必须含有能与某些氨基酸残基起 反应的化学基团 蛋白质的正常配位体、底物和抑制剂的结 构都可以作为设计亲和试剂的参考。
第8章 酶分子的化学修饰
酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因：
1)细胞外稳定性差；
2)反应条件严苛； 3)具有抗原性。
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子化学修饰的方法来改变已分 离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
3）消除抗原性。
4）产生新的催化能力。
8.1 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个活性反应基团， 可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产 生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
的活性部位。
酶抑制剂是通过作用于酶活性部位来降低酶催化能力的。
酶共价交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间 障碍阻挡抑制剂，“遮盖”酶活性部位，增强了酶抗抑制 剂能力。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解
酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶
和功能的方法。
• 酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋
白酶或肽酶为修饰剂）。
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种： • 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 • 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 • 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部 位，酶活力提高。
利用肽链的水解，可以使酶的空间结构发生某 些精细的变化，从而改变酶的特性和功能的方法， 称为肽链的有限水解修饰。
一、充分认识酶分子的特性
1. 活性部位情况
2. 稳定条件及反应最佳条件
（热稳定性、pH稳定性、最适pH、温度）
3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择
1）首先要与氨基酸反应残基发生化学反 应，形成紧密的共价链接。 2）与某一特定的氨基酸残基侧链基团特 异反应。
三、反应条件的选择
允许修饰能顺利进行；不造成蛋白质的不可逆变性；有利于
可定量测定酶分子中羧基的数目。
+
碳化二亚胺
酶-碳二亚胺衍生物
•硼氟化三甲烊盐和甲醇-HCl反应生成甲酯
4)咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂:
常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
+
修饰酶（240nm)
+ C2H5OH +CO2
烷基化修饰剂：碘乙酸
专一性修饰蛋白。
1. 酶与修饰剂的分子比例
2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件
3. 反应温度及时间
四、 修饰反应的一般程序
注意事项
修饰后需进行总的氨基酸分析
各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基
进行确定
注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和
修饰程度及对酶活性的影响
修饰后酶性质的改变
特定氨基酸残基侧链 基团的化学修饰
羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰
二硫键的化学修饰
（三）交联修饰（交联法）
用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不
同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。
（四）固定化修饰（共价偶联法）
通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接
到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺等。
烷基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。
氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
还原剂：巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）等。
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、
咪唑基，酚基等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关）
木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其 肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大 降低。
8.4 分子侧链基团修饰
侧链基团修饰
采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的 侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和 功能的修饰方法
酶侧链基团
组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨 基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、 羟基、胍基、甲硫基等
五、改变酶学性质
绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度并没有发生改
变。
但是有些酶在修饰后，米氏常数Km会增大。
空间障碍影响酶与底物的结合。
抵挡各种失活因子能力增强和体内半衰期的延长。
8.2 酶分子化学修饰的方法学
方法很多，充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特征，或
直接或间接与酶分子上的某种氨基酸残基进行化学反应。
作用
研究各基团的作用及其对酶的结构、特性和
功能的影响 (研究酶活性中心的必需基团)
改变酶分子性质，提高实用价值
测定某一基团在酶分子中的数量
获得新酶种
类别
蛋白类酶 核酸类酶
侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶 碱基上的氨基和羟基(酮基)等
8.4 分子侧链基团修饰
光亲和试剂
• 是一类特殊的亲和试剂 • 它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外 ，还具有一个光反应基团。 • 先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结 合，然后被光照激活后，产生一个活泼的 功能基团，能与它们附近基团反应，形成 一个共价的标记物。
4) 芳香环取代反应
试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代： I2＋
硝化：
+ HI
(NO2)4C +
（四硝基甲烷）
+(NO2)3CH
2. 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1)巯基的化学修饰
来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX