细菌内毒素检查法讲义

保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性
结果。

坚实凝胶

阳性“+‖

未形成凝胶
凝胶不坚实

阴性“—‖
鲎试剂灵敏度复核试验
结果判断：若最大浓度 2λ 管均为阳性，最低浓度
0.25λ 管均为阴性，阴性对照管阴性，试验方有效。
结果计算：反应终点浓度的几何平均值，即为鲎
试剂灵敏度的测定值
λc=lg-1(ΣX/4)

漩涡混合器
漩涡混合器
干热恒温器
恒温水浴
试验的准备
试验器械 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无 热原吸头）、凝集管（10×75mm）、试 管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器 、75%酒精棉、剪刀、砂轮。
试验的准备

试验器械的要求
– 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在
的外源性内毒素。常用的方法是在250℃ 干


计算举例
b 当 L 以 EU/mg 表示时，则 C 的单位为 mg/ml 或 U/ml 适用于 供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小 于xx EU/mg或EU/U。 例：注射用阿莫西林钠 计算限值为 0.15EU/mg，使用灵敏度为 0.25EU/ml 的鲎试剂 进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性 内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度 的溶液。 如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶 解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。

二、热原
热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质
细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）

内源性热原
产生细胞分裂素的物质
内毒素热原

外源性热原
非内毒素热原（病毒、细菌、真
菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）
热原和内毒素的关系：
热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内 毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是 主要的热原物质，可以说无内毒素就无 热原，控制内毒素就是控制热原。
浊度法 动态浊度法 终点浊度法 显色基质法 动态显色法 终点显色法
半定量实验

可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另 有规定外，以凝胶法结果为准。
试验的准备
实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37± 1℃ 电热干燥箱 250 ℃ 实验器械等
半定量试验
综述部分
1. 检查法的描述 2. 试验的准备 3. 限值（L）的确定 4. 确定最大有效稀释倍数（MVD）
细菌内毒素检查法的定义：

本法是利用鲎试剂与 细菌内毒素产生凝 聚反应的机理，以判断供试品中的细菌 内毒素限度是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查法介绍

细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 光度测定法



实验部分
凝胶法 a 鲎试剂灵敏度复核 光度测定法 a 标准曲线的可靠性实验
b 干扰实验 c 检查法：限量试验
半定量试验
b 干扰实验 c 检查法
鲎试剂灵敏度复核试验

目的
－考察鲎试剂的灵敏度是否准确 －考察检验人员操作方法是否正确
－实验条件是否符合规定

何时进行 －使用新批号的鲎试剂 －试验条件发生可能影响检验结果的改变时
2010年版药典细菌内毒素 检查法介绍

整体结构 1. 综述部分 – 检查法的描述 – 试验的准备 – 限值（L）的确定 – 确定最大有效稀释倍数（MVD）
2. 实验部分 凝胶法 a 鲎试剂灵敏度复核 b 干扰实验 c 检查法：限量试验

光度测定法
a 标准曲线的可靠性实验 b 干扰实验 c 检查法
– 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际
情况做必要调整，但需说明理由。
限值（L）的确定

限值计算时做必要调整的几种情况
– 从严原则
– 联合用药
– 特殊情况等
确定最大有效稀释倍数（MVD）
最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最 大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素 限值的检测。 MVD＝cL／λ L：供试品的内毒素限值 c：供试品溶液的浓度 λ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)， 或在光度测定法中所使用的标准曲线上最 低的内毒素浓度(如标准曲线为50、5、 0.5EU/ml三个浓度组成)
细菌内毒素标准物质

a 国家标准品
以内毒素国际标准品为基准标定效价。系自大肠埃系菌提取精制而
成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品 的效价。
150600-200707

10000EU/支
b 工作标准品
以内毒素国家标准品为基准标定效价。用于试验中鲎试剂灵敏度复 核、干扰试验及各种阳性对照。
烤至少30分钟，也可采用其他确证不干扰细 菌内毒素检查的适宜方法。
– 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器
配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对 试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微 生物是污染。
试验的准备

供试品溶液的制备
– 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中
浸提制成供试品溶液。
– 一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。
注射剂K= 5EU/(kg· h)，放射性药品注射剂K= 2.5EU/(kg· h)，鞘内用注 射剂K= 0.2EU/(kg· h)；
– M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg· h)、
mg/(kg· h)或U/(kg· h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡ 计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面 积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）

鲎试剂灵敏度复核试验
内毒素浓度 2λ λ 0.5λ 0.25λ 阴性对照
○
鲎试剂 平行管
○ ○
○ ○
○ ○
○ ○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
鲎试剂灵敏度复核试验

放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°， 若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑 脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁 滑脱者为阴性；
鲎
鲎试剂

鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色 的。鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的 主要成分是血蓝蛋白。这种蓝色血液的提 取物——―鲎试剂”。鲎试剂是由海洋生 物鲎的血液提取物制成的“鲎试剂”，能 够准确、快速地检测人体是否因细菌感染 而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测 细菌内毒素。目前使用的鲎试剂分为美洲 鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。


MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.25EU/ml＝12倍

如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；

适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有 效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。 例：注射用阿莫西林钠
计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为 0.125EU/ml 的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度 c ＝0.125 EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml

确定最大有效稀释倍数（MVD）

计算举例

a 当L以EU/ml表示时，则浓度C的单位为1.0ml/ml
适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应
小于xx EU/ml。

例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用

Baidu Nhomakorabea
灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则：
MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍

三、鲎

鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫 (现在 只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出 现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当 时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世， 随着时间的推移，与它同时代的动物或 者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿 多年前问世至今仍保留其原始而古老的 相貌，所以鲎有“活化石”之称。又具 有很高的药用价值。
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。
（反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后 一个呈阳性结果的浓度。）
鲎试剂灵敏度复核试验
内毒素浓度 2λ ● 鲎试剂 平行管 ● ● λ ● ● ● 0.5λ ○ ○ ● 0.25λ ○ ○ ○ 阴性对 照 ○ ○ 终点 λ λ 0.5λ
●
●
●
○
0.5λ
λc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ
细菌内毒素检查法
常胜凯 药理室
背景介绍：
一、细菌内毒素 二、热原 三、鲎
一、细菌内毒素

细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞 壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放 出的一类具有多种生物活性的毒性物质
特性：
（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释 放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引 起发热反应。 （2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭 活。 （3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水， 在水中呈不均匀分布。 （4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应 ，形成凝胶。
凝胶法干扰试验
预试验 正式干扰试验
预试验

目的： 初步确 定供试 品的最 大不干 扰浓度
（当限值以 EU/mg 或 EU/U 活性单位表示）或 最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示）， 为正式干扰实验提供依据；

优点：减少摸索过程、节省成本。
预试验

操作步骤：
将供试品溶液进行一系列倍数的稀释； 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一 稀释倍数下做 2 支供试品管和 4 支供试品阳性 对照（即含 2.0λ 和 0.25λ 浓度标准内毒素的该 浓度的供试品稀释液）； 另做2支阴性对照和2支阳性对照。

预试验

预试验结果判断： 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有 效； 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳 性对照2管为阳性时，供试品阳性对照0.25λ管均为阴 性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释 倍数即为最小不干扰稀释倍数。 即可选择该稀释倍数和相邻浓度进行正式干扰实验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素
检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干 扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两 个以上鲎试剂厂家的试剂）
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试
验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变 化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查 时，供试品阳性对照为阴性时。


正式干扰试验

目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试 剂与内毒素的反应有无干扰作用。 通过比较鲎试剂与在水溶液中的内毒素和供 试品溶液中的内毒素反应的差异程度，来确 定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干 扰。

正式干扰试验 操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内 毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液
实验操作:
取细菌内毒素国家标准品或 工作标准品一支，加入规定 量的细菌内毒素检查用水溶 解其内容物，用封口膜将瓶 口封严，置旋涡混合器上混 合15分钟。 然后进行稀释，制备成4个 浓度的细菌内毒素标准溶液 ,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ （λ为所复核的鲎试剂的标 示灵敏度），每稀释一步均 应在旋涡混合器上混合30秒 钟。
鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细
菌内毒素检查。
实验时，以标示灵敏度 λ 为该批鲎试剂的灵敏度。
凝胶法干扰试验

目的：是确定供试品在多大的稀释倍数 或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存 在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检 查法提供依据。
凝胶法干扰试验
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品， 需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使 用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的 缓冲液调节pH值。
– 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
限值（L）的确定
– 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以
下公式确定：
L＝K／M
– K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg· h)表示，
150601-200968
150EU/支
150601-201072
120EU/支
细菌内毒素检查用水

用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及 样品、溶解鲎试剂等
a 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素 含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水 b 光度测定法细菌内毒素检查用水，其内 毒素含量应小于0.005EU/ml