聚肌胞诱导鸡胚成纤维细胞和鸡胚及肉鸡抵抗新城疫病毒感染的研究

收稿日期 : 2008201228 基金项目 : 江苏省科技攻关 (三药 ) 项目 (BE2005605) 作者简介 : 吕英军 , 博士研究生 , E2mail: lvyingjun963@1631com。3 通讯作者 : 鲍恩东 , 教授 , 博导 , 主要从事动物免疫病理及分子病
理方面的研究 , E2mail: b_ endong@ njau1edu1cn。
An tiv ira l effects of Poly I∶C on the ch ick em bryo f ibrobla st
and em bryos and bro ilers infected by ND V
LΒ Ying2jun, N I J ia2ning, BAO En2dong3
南京农业大学学报 2009, 32 (2) : 972101 Jou rna l of N an jing A g ricu ltu ra l U n njau1edu1cn
吕英军 , 倪嘉宁 , 鲍恩东. 聚肌胞诱导鸡胚成纤维细胞和鸡胚及肉鸡抵抗新城疫病毒感染的研究 [ J ]. 南京农业大学学报 , 2009, 32 ( 2) : 972101
聚肌胞 (polyinosinic ∶polycytidylic acid, Poly I∶C) 是由聚肌苷酸和聚胞苷酸在一定条件下聚合而 成的一种错配的双股 RNA , 是一种高效干扰素 ( interfern, IFN ) 诱生剂 , 具有广谱抗病毒 、抗肿瘤 、 抗某些细菌和原虫感染 、刺激吞噬 、调整机体免疫等多种保护功效和作用 [ 1 - 2 ] 。聚肌胞在人类医学中被 广泛应用于治疗肝炎 、疱疹病毒感染及一些肿瘤性疾病 [ 3 - 5 ] 。在兽医临床上 , 虽然也见有聚肌胞治疗鸭 瘟 [ 6 ] 、猪瘟 [ 7 ] 、鸡马立克氏病 [ 8 ]以及对新城疫 (Newcastle disease, ND ) 感染的保护率试验 [ 9 ]等的报 道 , 但缺乏系统研究 。兽医临床上也存在治疗病毒性疾病的迫切要求 。为此 , 本试验通过聚肌胞对感染 NDV 的鸡胚成纤维细胞 (CEF) 、 SPF鸡胚和肉鸡的病毒抑制试验 , 探讨聚肌胞对 ND 的治疗效果 , 为 其可能在兽医临床应用提供试验依据 。
聚肌胞诱导鸡胚成纤维细胞和鸡胚及肉鸡 抵抗新城疫病毒感染的研究
吕英军 , 倪嘉宁 , 鲍恩东 3
(南京农业大学动物医学院 , 江苏 南京 210095)
摘要 : 为探讨多聚核苷酸 (聚肌胞 ) 对新城疫病毒 (NDV ) 的抑制作用 , 本研究通过聚肌胞对感染 NDV 的鸡胚成纤维 细胞 、 SPF鸡胚和肉鸡进行了病毒抑制试验 。结果显示 : 125和 250μg·mL - 1的聚肌胞溶液能明显抑制 100倍 TC ID50的 NDV在鸡胚成纤维细胞上的繁殖 ; 5 mg·mL - 1的聚肌胞溶液 (每个胚 011 mL ) 能明显抑制 NDV 在 SPF鸡胚中的繁殖 , 减轻 NDV对鸡胚生长的抑制作用 , 降低病毒血凝效价和鸡胚死亡数 。聚肌胞对肉鸡抵抗 NDV 感染试验结果显示 , 肌肉 注射 0101 mg·kg- 1的聚肌胞注射液能明显提高治愈率和显效率 。但反映细胞活性状态的中性红染色 (D570值 ) 随着聚肌 胞浓度的增大而变小的结果说明 , 聚肌胞对鸡胚成纤维细胞的增殖有一定程度的抑制 。 关键词 : 多聚核苷酸 (聚肌胞 ) ; 新城疫病毒 ; 抗病毒 ; 鸡胚成纤维细胞 ; 鸡胚 ; 肉鸡 中图分类号 : S85917 文献标志码 : A 文章编号 : 100022030 (2009) 0220097205
(College of Veterinary M edicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Ab s tra c t: To investigate the effect of polyinosinic ∶polycytidylic acid ( Poly I∶C) on Newcastle disease virus (NDV ) , antiviral effects of Poly I∶C were studied using different dosage of Poly I∶C on the chick embryo fibroblast (CEF) , SPF embryos and broil2 ers infected by NDV in this paper. The results revealed that NDV p roliferation was significantly inhibited by the dosages of 125 and 250μg·mL - 1 Poly I∶C respectively on the CEF cells which infected by 100 TC ID50 NDV. In vivo experiment, NDV p roliferation was significantly inhibited by the dosages of 5 mg·mL - 1 Poly I∶C on the SPF chick embryos ( 011 mL per egg) , and the result showed the reductions of NDV hemagglutination and the mortality rate of chick embryos. The result also exhibited that the weight of chick embryos increased significantly w ith the dosages of 5 mg·mL - 1 Poly I∶C compared w ith positive control. The result of antivi2 ral effects of Poly I∶C on broilers exhibited that the dosage of 0101 mg·kg- 1 Poly I∶C by intramuscular injection enhanced the recovery rate and excellence rate. However the value of D570 , which reflected activity of CEF, showed that the toxic effect of Poly I∶C reduced the p roliferation of CEF cells with the adding dosage of Poly I∶C. Ke y wo rd s: polyinosinic∶polycytidylic acid ( Poly I∶C) ; NDV; antiviral effect; CEF; chick embryo; broiler
·98· 南 京 农 业 大 学 学 报 第 32卷
1 材料与方法
111 材料 NDV LaSota株由瑞普 (保定 ) 生物药业有限公司质检室提供 ; NDV F48E8标准株由中国动物卫生 和流行病学中心新城疫国家参考实验室提供 , E ID50 ( egg infective dose) 为 10 - 8 mL - 1 ; 10 日龄 SPF种 蛋购自北京梅里亚 2维通实验动物技术有限公司 ; 180只 1日龄科宝 480肉用仔鸡购自青岛正大有限公司 孵化场 , 试验期间投喂全价肉用仔鸡前期配合饲料 ; 聚肌胞注射液 (主要成分为聚肌苷酸 2聚胞苷酸 , 含量 10 m g·mL - 1 ) 、鸡干扰素注射液 (批号 07111201, 效价 210 ×106 IU ·mL - 1 ) , 均由瑞普 (天津 ) 生物药业有限公司提供 ; DM EM 培养基 , Gibco公司产品 ; 优级新生牛血清购自中美合资兰州民海生物 工程有限公司 ; 细胞消化液含 215 g·L - 1胰蛋白酶 、012 g·L - 1 EDTA 2Na2 , D 2Hank′s液配制 。 112 聚肌胞对离体培养 C EF抵抗 NDV (La So ta 株 ) 感染影响试验 11211 NDV 的传代和效价测定 将病毒液接种于 10日龄鸡胚绒毛尿囊腔 , 每胚 012 mL , 37 ℃孵育 , 5 d后收集尿囊液 。用红细胞凝集 (血凝 ) 实验测定血凝效价为 10 ( log2 ) 。 11212 聚肌胞对 C EF的毒性 常规方法制备 CEF[ 10 ] , 待长满单层后 , 消化传代备用 。取长满单层的 次代细胞一瓶 , 消化后加入含 10%小牛血清的 DM EM 培养液 , 接种于 96孔细胞培养板 , 每孔 100 μL , 37 ℃培养 。待铺满单层后 , 弃去培养液 , 用 Hank′s液洗涤 2 次 。将聚肌胞用 DM EM 稀释成 30、 60、 120、250、500、800和 1 000 μg·mL - 1共 7个梯度 , 然后将 7个质量浓度梯度的药物分别加入已长成 单层的细胞板中 , 每孔 100μL , 每个浓度重复 5孔 , 并设正常细胞对照 。作用 115 h后去掉药物 , 加入 含 2%小牛血清的 DM EM 继续培养 60 h, 观察细胞生长状态 。利用中性红染料吸收法 [ 11 ]测定细胞活性 : 测定前 2 h每孔加入 50μL中性红染液 , 测定时倒掉孔内液体 , 用 PBS冲洗细胞 3次 , 每孔加入 200μL脱 色液 , 置微孔板振荡器振荡 10 m in, 置于酶联免疫检测仪上测定 D570值 , 作为细胞活性检测指标。 11213 NDV 滴度测定 参照 11212制备铺满 96孔板的单层 CEF, 用 Hank′s液洗涤 2次后分别加入用 含 2%小牛血清的 DM EM 10倍连续倍比稀释的病毒液 , 从 10 - 1到 10 - 11共 11个浓度 , 每孔 200 μL , 每 个浓度重复 4孔 , 并设正常细胞对照 。37 ℃、5% CO2 培养箱内培养 7 d, 观察细胞病变 (CPE) , 按照 Reed2M uench法计算 TC ID50 ( tissue culture infective dose) 。 11214 微量细胞病变抑制法测定聚肌胞对 NDV 的抑制作用 参照 11212制备铺满 96孔板的单层 CEF, 用 Hank′s液洗涤 2次后分别加入不同质量浓度梯度的聚肌胞溶液 (30、60、120和 250μg·mL - 1 ) , 每 孔 50μL , 每个质量浓度重复 5孔 。空白对照组 , 只加 50μL 培养液 。37 ℃、5% CO2 下吸附 115 h, 倒 掉培养液 , 然后加入 100 TC ID50的 NDV , 每孔 200 μL。37 ℃、5% CO2 下继续培养 , 观察各组细胞病 变 , 利用中性红染料吸收法测定细胞活性 。 113 聚肌胞对 S P F鸡胚抵抗 NDV (La So ta 株 ) 感染试验 11311 聚肌胞对鸡胚的毒性 将聚肌胞溶液用灭菌生理盐水稀释成 10100、 5100、2150 和 1125 mg· mL - 1 , 以每个质量浓度接种健康受精的 10日龄 SPF鸡胚 4枚 , 每胚 011 mL。37 ℃培养 5 d后观察鸡胚 死亡情况 , 测定胚体质量 , 判定药物对鸡胚的毒性 。 11312 E ID50测定 将 NDV用灭菌生理盐水连续稀释成 10- 7 、10- 8 、10- 9 、10- 10 , 每个病毒浓度接种 10 日龄 SPF鸡胚 5枚 , 每胚 011 mL。37 ℃培养 5 d后观察鸡胚死亡情况 , 按照 Reed2Muench法计算 E ID50。 11313 聚肌胞对 NDV 抵抗作用 取健康受精的 10日龄 SPF鸡胚 60枚 , 随机均分为 6组 , 即 4个聚肌 胞药物剂量组 (分别为 5100、2150、1125 和 0163 mg·mL - 1组 ) 、阳性对照组 (只接种病毒 ) 和阴性 对照组 (生理盐水 ) 。将不同质量浓度梯度的聚肌胞溶液经尿囊腔注入相应的 4个药物剂量组鸡胚中 , 每胚 011 mL , 阳性对照组和阴性对照组均注入相同剂量的生理盐水 。24 h后 , 除阴性对照组外 , 每组 以相同的途径注入 100 E ID50的病毒溶液 , 每胚 011 mL; 阴性对照组以生理盐水代替 。37 ℃培养 5 d, 统计鸡胚死亡数 ; 收集尿囊液 , 按照微量法测定血凝效价 ; 鸡胚称重 ; 观察鸡胚的病理变化 。 114 聚肌胞对肉鸡抵抗 NDV ( F48 E8 标准株 ) 感染试验 11411 试验分组 将 180只试验鸡随机均分成 6组 。聚肌胞受试药物组分为高 ( 0102 mg·kg- 1 ) 、中 (0101 m g·kg- 1 ) 、低 ( 01005 mg·kg- 1 ) 3 个剂量组 , 分别按剂量肌肉注射 2 次 , 注射间隔时间为 3 d; 对照药物组鸡按每羽 20 000 IU 的剂量肌肉注射干扰素注射液 , 每天 1次 , 连用 3 d; 攻毒对照组