新兽药特殊毒性试验技术要求

新兽药特殊毒性试验技术要求

新兽药特殊毒性试验技术要求

限于国内现有条件，经研究确定新兽药特殊毒性试验（“三致试验”）一般只进行致突变试验和致畸试验。在致突发试验中，考虑到检测终点应有原核细胞和真核细胞，基因突变和染色体畸变，体内和体外试验系统，体细胞和生殖细胞之分，确定Ames试验和微核试验为必做试验。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者可以任选一项，若前二者任一项为阳性均必做显性致死试验。这样，在致突变试验中必须至少做三项试验。在致畸试验中，对一般兽药来说，传统致畸试验为必做试验；对饲料药物添加剂还应增加养致畸试验，喂养繁殖毒性试验。喂养繁殖毒性试验一般只做一代繁殖毒性，一代为阳性时应再做第二代繁殖毒性，即：

各项试验方法如后：

一、艾母氏（Ames）试验方法

1、菌种

组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准株。

2、菌种鉴定

以上菌种需分别作抗氨苄、抗四环素、抗紫外、结晶紫、组氨酸需求、自发回变数的鉴定。

3、剂量分组

每次试验要求4～5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。液态受检物的剂量从0.05～50μl/皿之间选择，固态受检物从0.1～1000.0μg/皿之间选择，最高剂量可达5000.0μg/皿。选定后的剂量应配制成适当浓度，使每皿加入受检物的体积为100μl或200μl。

4、溶剂

一般以水为溶剂，选用其他溶剂需说明理由。

5、对照物

每次检测要求同时作阳性和阴性对照；用已知的阳性物作阳性对照，用溶剂作阴性对照。加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿。

6、S9制备

选体重200克左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱导后宰杀，处死前12小时禁食。在低温条件下，无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或-80℃冰箱中。制得的S9需作S9活力测定。

7、试验步骤

将经鉴定合格的TA97a、TA98、TA100和TA102菌株分别接种于增菌培养液中。37℃水浴振荡培养，每毫升活菌数不得少于1～2×109。

受检物，包括对照物，按设计剂量配制。取受检物0.1～0.2ml，菌液0.1ml，S9混合液0.5ml或磷酸缓冲液0.5ml，依次加入无菌小试管中，37℃水浴振荡

培养20分钟后（也可采用平板掺入法），加入45℃顶层培养基2.0ml，混匀倒入含底层培养基的平皿上，37℃培养48小时。

8、结果评价

在计数菌落前应先观察背景菌苔的生长情况，正常的背景菌苔应呈均匀的砂粒状。受试组与阴性对照组的背景菌苔应一致，阴性对照组的自发回数应在正常值之内。

受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂量反应关系和重现性，判为诱变阳性。

二、微核试验

1、动物

选择成年健康小鼠（应注明品系），将小鼠随机分为受试组和对照组。每组动物数不少于10只（雌、雄各半）或至少6只雄性动物。

2、受试物的处理

将受试物溶于适宜的溶剂中，以0.1～0.2ml/10g体重的给药体积配制成适当的浓度。

3、给药方式

原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。给药剂量以LD50为依据，设3个剂量组。高剂量组应出现毒性反应，一般可采用LD50的0.8～0.5；低剂量组的给药量为LD50的0.05～0.10。

每次试验应同时设阴性对照组和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂。

４、试验操作

一次给药一般在24，48，72小时取样制片。或二次给药，从第二次给药后的6，24小时取样制片。处死小鼠取骨髓，将骨髓洗入离心管中，离心。常规涂片。姬姆萨染色，镜检。

5、镜检

采用双盲法计数分析，每只小鼠在同一张片子上计数1000个嗜多染红细胞，同时计数嗜多染红细胞（PCE）同正染红细胞（NCE）之比。必要时，亦可采用吖啶橙染色，荧光显微镜分析计数。

6、结果评价

将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及PCE/NCE之比。所得结果用t 检验进行数据分析，经重复试验P<0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。

三、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验

１、细胞

采用中国仓鼠卵巢细胞系CHO，染色体数目21。或中国仓鼠肺细胞系CHL，染色体数目25。

2、细胞培养

使用MEN-Eagle’s培养基或1640培养基，配制完全培养液，加15％灭活的小牛血清，100IU/ml青霉素，调节PH7.2～7.4。进行常规单层细胞培养。在细胞处于指数生长期时用胰酶-EDTA液处理，并自培养瓶表面将细胞洗脱下来。计数每毫升培养液含有的细胞数。在含有10ml培养液的25cm2的培养瓶中加2～

5×105个细胞。在37℃，湿度95%，5%CO2培养箱中培养过夜。

3、试验分组与剂量

试验分3个受试组，另设阴性和阳性对照组。高剂量组以50%细胞生长抑制浓度为准，否则应说明理由。低剂量组接近于阴性对照组细胞成活率。各组均需有加S9和不加S9试验。

4、试验操作

向经过夜培养的培养瓶中依次加入S9，受试物或对照物。培养18～22小时。在细胞收获前2～4小时，加秋水仙素，使最终浓度为每毫升培养液0.1μg，胰酶洗脱后加入含小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用。0.075mol氯化钾溶液低渗处理，甲醇：冰醋酸液固定，离心，取混匀沉淀舞常规制片，姬母萨染色。镜检分析。

5、结果评价

采用双盲法镜检分析。每个剂量组的两个培养物至少各分析100个中期相细胞。将数据列表，分别列出数目畸变和结构畸变数，所得结果用t检验进行数据分析。经重复试验P<0.01，并有剂量反应关系时为染色体畸变阳性。

四、显性致死试验

1、动物

一般用大白鼠，也可用小白鼠。为保证试验结果的重现性，应用近交系或近交系之间杂交的F1代。雌、雄鼠不能来自同一杂交群。所有试验动物都应达到性成熟，雌鼠应未交配过。

2、剂量

应设三个剂量组，一个阳性和一个阴性对照组。每组用雄鼠10只。高剂量应导致毒性症状，明显降低繁殖率，约为LD50的1/10。低剂量为LD50的1/100。

3、给药方式

原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。受试物应连续给药5天，每天一次。

4、交配方法

在最后一次给药的当天，将雄鼠与雌鼠按1：2同笼，第5天取出雌鼠，间隔2天后再防入新的雌鼠。如此需要连续8～12周（大鼠）或6～8周（小鼠）。查出阴栓的当天为妊娠第0天，未查出者以同笼第4天为妊娠第0天。