特殊毒性试验
新药药理学：特殊毒性试验
皮肤光毒性试验
光毒性反应指药物吸收的紫外光能量在皮 肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或 全身接触或应用化学物质后，继而暴露在 紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应
临床表现与晒伤相似：红斑、水肿、皮肤 瘙痒、色素沉着，甚至局部坏死、溃烂或 表皮脱落
皮肤光毒性试验
试验动物：成年白色豚鼠 试验分组：设阴性、阳性（8-甲氧基补骨脂素） 对照及受试物不同剂量组 试验前24h，将脊柱两侧皮肤去毛，2x2cm2 涂敷相应药物30min后，一侧用铝箔覆盖，一侧 用UVA照射 根据评分标准判定皮肤反应 1只或以上动物皮肤反应分值≥2，受试物具有光 毒性
溶血性试验
❖ 溶血性试验：观察受试物是否能够引起 溶血和红细胞凝聚等反应
❖ 凡注射剂和可能引起免疫性或非免疫性 溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血 性试验
溶血性试验
❖ 制备血红细胞悬液，加入受试物，充分混匀 后观察：
红细胞全部下沉，上清液体无色透明，说明无溶 血
溶液呈澄明红色，管底无细胞或有少量红细胞残 留，表明有溶血发生
眼刺激性试验
眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行 眼刺激性试验 首选家兔，可采用同体左右侧自身对比法 试验前24h需检查动物双眼 每只眼睛滴入0.05~0.1ml或涂敷0.1g受试物 给药后1、2、4、24、48及72h进行眼部检查 持久性损伤需延长观察期限，一般不超过21d 采用裂隙灯进行眼部检查，记录眼部反应分值， 判断刺激程度
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
中药A注射剂特殊毒性实验 药理实验
中药A注射剂特殊毒性实验【实验目的】通过对中药A注射剂的刺激性、过敏性、溶血性实验，研究该注射剂的安全性。
【实验原理】略。
【实验材料】动物：SD大鼠20只，雌雄各半，200—250g；豚鼠60只，雌雄各半，200—250g；家兔1只，1.5～2.0 kg。
试剂：中药A注射剂，75%乙醇，蛋清，蒸馏水，0.9%氯化钠溶液，苦味酸试剂。
仪器：全光谱灯，离心机，恒温箱，含玻璃珠的三角烧瓶，剃须刀，砂纸，玻璃纸，胶布，绷带，试管，玻璃棒，载玻片。
【实验方法】（一）刺激性试验方法皮肤刺激性试验1 实验动物选SD大鼠，20只，雌、雄各半。
设赋形剂（75%乙醇）对照，采用同体左右侧自身对比法。
试验前24小时对背部给药区用剃须刀进行脱毛处理。
去毛范围左、右各3 cm×3 cm。
给药前检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不进行试验。
进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。
2 给药方法取受试物0.5 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm×2.5 cm）和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂75%乙醇作对照。
贴敷时间4小时。
贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。
3 结果观察在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。
按表1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。
①单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。
如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。
但延长期一般不超过14天。
对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。
4 结果评价计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表2进行刺激强度评价。
表1.皮肤刺激反应评分标准判断指标：表2.皮肤刺激强度评价标准（二）过敏性试验方法全身主动过敏试验（ASA）对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。
特殊毒性及其试验与评价方法2
（4）胎仔检查
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鼠类有食畸形胎仔的习性，应在预期分娩前1 d～2 d处死母鼠进行检查。 一般大鼠在受孕后第19～20d，小鼠第18～19d。 剖检前称量并记录母鼠最终体重。
常采用颈椎脱臼法或断头处死法处死动物。
从腹中线剖腹，暴露子宫和卵巢，为胎仔检查做 准备。
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活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按 窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检 查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检 查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检 查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限 活产胎仔。
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将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比 例为1︰1或2︰1，直到受孕或进行3周为止。 雌鼠受孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交 配3周后，如仍未受孕，则停止交配，并进行 生殖器官病理学检查。
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确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片， 检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精 日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易 脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或 检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
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亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死 亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠 断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共 生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲 鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情 况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育 成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a， F2a断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶后， 将F1b淘汰。F2b交配处理方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次，所产仔 鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
特殊毒性试验
三、人群流行病学调查
➢ 动物致癌试验，根据阳性结果 检出潜在的人类致癌物
➢ 描述流行病学调查或临床观察 发现怀疑人类致癌物
➢ 病例-对照研究 ➢ 队列研究
四、致癌作用模型
转基因动物 (transgenic animal)
借助基因工程技术将确定的外源基因通 过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色 体上，在其基因组内稳定地整合经导入的外 源基因，并能遗传给后代的一类动物
化学、物理或生物等致癌因素作用于细胞 后，引起原癌基因突变使之激活，转变成癌 基因后才会导致细胞癌变
2．抑癌基因 (anti-oncogene)
正常细胞分裂生长的负性调节因子， 其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂 活性，或称为肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)、肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene)
致癌毒性试验
肿瘤(tumor，neoplasm) ：有分裂潜能的细胞 受致癌因素作用后发ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ恶性转化和克隆性增生 所形成的新生物
良性肿瘤：呈膨胀生长，与周围组织有明显的 界限，多有包膜，它们生长常有“自限性”， 对机体破坏较小
恶性肿瘤：癌和肉瘤
癌(carcinoma)：由上皮细胞来源的恶性肿瘤
肉瘤(sarcoma)：由间质细胞来源的恶性肿瘤
第三节
观察化学毒物致癌作用的 基本方法
化学致癌物的判别
➢ 人群流行病学调查：两项以上由不同 研究者在不同地点、不同对象中以不同 调查方法获得的结论相符的证据；
➢ 动物实验证据：两项按现行常规设计 进行，符合GLP（good laboratory practice），在不同物种动物中所得结果 一致的动物致癌物鉴定资料。
盐酸普鲁卡因半数致死量_LD50的测定
启动微机，运行BL-410程序，进入其数据处理选项， 再进入半数有效量选项。
一次输入各组剂量、动物总数、动物死亡数等相关 数据。
单击“计算”按钮，计算LD50等参数。
【注意事项】
给药剂量准确 小鼠腹腔注射 脱臼处死实验用过小鼠
【思考题】
1.测定LD50有何药理意义？
2.为何选择测定LD50作为衡量药物 毒性大小的指标?
C母 D 等容注射量
药液配制的具体步骤：
预试中Dm=344mg/kg， Dn=141mg/kg，算出r=1.25，小鼠的平均体 重为20g，每组10只，用药量为0.1ml/10g=10ml/kg
C母
D 等容注射量
C1=344mg/kg / 10ml/kg=34.4mg/ml
每组药液量=每组动物总重×用药量=200g×0.1ml/10g=2ml
【实验材料】
实验动物：小白鼠，体重18～２２g，♀♂各半，
实验前禁食12h,不禁水。
实验器材：计算机（BL-410机能实验系统）、电 子秤、注射器、小鼠笼。
实验药品：盐酸普鲁卡因 （Procaine hydrochloride）
【实验步骤】
预备实验
1．探索剂量范围：根据经验或文献，通过实验找出100%死亡的最小剂
(3)申报新药过程中必须提供的药理学资料
盐酸普鲁卡因产生毒性作用的原理:
盐酸普鲁卡因是一种局部麻醉药，当被大量吸收后会产
生全身性毒性反应，主要表现为枢神经系统先兴奋后抑
制，初期表现为眩晕、烦躁不安、肌肉震颤，进而发展为
神经错乱、惊厥、昏迷、呼吸抑制等。患者可因呼吸衰竭 而死亡。
107853-药理学实验3盐酸利多卡因半数致死量_LD50的测定
小鼠的腹腔注射方法
抓好后将小鼠保持头低位，臀部在高位
给药位置：下腹部，腹中线的左右两侧； 给药方法：先刺入皮下，再将针头以45度角 刺入腹腔内约1cm，切不可过深，注入药液。
4. 观察30min，统计各组小鼠的死亡数（停止呼吸），计
算各组的死亡率。
5.计算LD50
LD50＝lg-1 [Xm－i(Σp－0.5)] ❖ Xm：最大剂量组剂量的对数值。 ❖ i：相邻两组给药剂量（D）对数值之差。 ❖ P：各组动物的死亡率，用小数表示。 ❖ ΣP：为各组动物死亡率的总和。
静脉给药，对中枢神经系统有兴奋和抑制双相作用。 ✓ 血药浓度较低时，出现镇痛和思睡、痛阈提高； ✓ 随着剂量加大，作用或毒性增强，出现肌肉震颤、惊厥昏
迷及呼吸抑制等中毒反应。
❖ LD50的测定方法有很多。如：加权机率单位法 (Bliss 氏法)、寇氏法（Karber氏法）等。
❖ Bliss 法要求剂量按等比级数排列，每组小鼠数相 等，剂量范围接近或等于0~100%死亡率之间，一 般分为5~8个剂量组。
❖ 我国卫生部规定，Bliss法是作为新药LD50测定评 定必须采用的方法。
【实验目的】 1.掌握药物的半数致死量测定方法和计算方法。 2.了解盐酸利多卡因给药后动物所产生的效应。
【实验材料】
❖ 实验动物：小白鼠（昆明种），体重18～22g， ♀♂各半。
❖ 实验器材：电子秤、注射器、小鼠笼。 ❖ 实验药品：盐酸利多卡因（20mg/mL）
C母
D 等容注射量
✓Cm=183.11mg/kg / 10ml/kg=18.311mg/ml
✓每组等比稀释液量=每组动物总重×用药量 =200g×0.1ml/10g=2ml
特殊毒性new
有关问题
受试物配制
样品难溶于水或其它溶剂，不能注射给药时，可改为 灌胃。口服给药尽量研磨均匀，必要时制成混悬液。 对细菌或细胞试验时，则可以将样品充分研磨均匀， 用水或其它合适的溶剂充分浸取灭菌后使用。
剂量设计
剂量设计与急性毒性的LD50值有关。但少数低毒西药 和MT许D多；基也因有工少程数产药品品，制往备往困测难不和出价L格D昂50值贵，，只此能时测允许 用多少倍ACD或MTD来表示。细胞染色体畸变试验， 毒性很低不能测出50%细胞生长抑制浓度时，其最高浓 度以不超过10mM为宜
如某些阳性或可疑阳性时，可选择哺乳动物培养 细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
细胞: 建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期 检查核型和有无支原体等污染。-80℃或液氮 冻存
剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准， 最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采 用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少３ 个剂量
有关问题
结果的判定
阳性：有统计学意义、量－效关系、可重复 阴性：结合是否达到MTD，有无阳性对照 阳性物对照组不可省
其它问题
实验设计：剂量，对照组、观察指标、统计方 法、给药周期、给药途径、结果判定应合理
资料整理应规范
3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或 SOS显色试验
生殖毒性(致畸)试验
一般生殖毒性试验 致畸敏感期毒性试验 围产期毒性试验
生殖毒性试验----致畸敏感期毒性试验
动物：首选Wistar 或SD大鼠，也可用小鼠或家兔 Ｉ类最好增加家兔或猪、猴、狗之一
动物数：每组孕大、小鼠≥１５只，孕兔≥ ８只 剂量：高、中、低三个剂量，限度剂量为1g/kg。
毒性试验
遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。
一般而言，根据其检测的遗传学终点可分为4种类型：检测基因突变；检测染色体畸变；检测染色体组畸变；检测DNA原始损伤。
长期毒性试验
长期细胞毒性试验一般是在急性毒性试验结果的基础上，观察评价动物反复给予受试物后，机体产生毒性反应的特征及其毒性损害的严重程度，以及主要毒性靶器官及其损害的可逆性。
急性毒性试验
急性毒性试验是指在24小时内动物接受药物1-2次（间歇时间为6-8小时），观察给药后动物7-14天内所产生的急性中毒反应。
急性毒性试验可确定被研究药物的毒性程度，即剂量和不良反应之间的关系，亦可以比较被研究对象与其他已知急性毒性物的相对毒性程度，通过对不同给药途径出现毒性作用的比较研究， 就可以确定药物不同接触途径的相对危害。
受试物长期毒性试验的目的是提供受试物的无毒性反应剂量和临床主要检测指标，为制定人用安全剂量提供参考资料。
因此长期毒性试验的设计 最好能包括神经病理学、生理学、生物化学及相关的形态学指标的监测，还应注意受试物再组织中可能的蓄积，以及通过其他机制产生的延缓毒性作用等。
北校区北门2205师母,13515209736
致畸敏感期毒性试验大鼠致畸敏感期毒性试验：按受试品剂量分组，对雌性大鼠受孕后的第6-15天连续给药。观察受试品对胎仔外观、体重、身长、尾长、内脏和骨骼等的影响，并与生理盐水对照组比较。
围产期毒性试验大鼠围产期毒性试验：按受试品剂量分组皮下注射给药，给药时间为孕鼠妊娠15天开始至分娩后28天，观察受试品大、中、小三个剂量组，对大鼠胚胎后期生长发育、母鼠分娩、以及新生F1代大鼠的生理发育指标、神经反射发育指标和生殖功能，并与生理盐水对照组比较。
药物毒理学实验
重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计
算半数致死量（LD50）。据此分析受试动物毒性反应 与剂量的关系，并根据LD50值对药物进行毒性分级。
三.实验材料
（1）器材
（2）药品
1ml注射器、电子天平、记号笔、镊子、剪刀等。
盐酸赛拉嗪注射液。
（3）动物
实验一
急性毒性试验
•
（一） 药物LD50的测定
一、实验目的
（1）理念——是药三分毒;
（2）了解一些常规药物毒理学的试验方法， 及评价指标; （3）掌握药物急性毒性试验的试验设计方 法、LD50的测定及计算方法。
二. 实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法，
根据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一
死试验。
（2） 致癌实验： 短期致癌实验和长期致癌实验。
（3） 致畸胎试验：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期给药，观察对子代的影响。
最大耐受剂量(MTD)
指在外来化合物急性毒性实验中,化学物质不引起
受试对象(实验动物)出现死亡的最高剂量,故可缩写为LD0。一般不用最大耐 受剂量来比较两种外来化合物的毒性。 治疗指数 为药物的安全性指标。通常将半数中毒量（TD50）/半数有
察受试区皮肤的变化，有无红斑、水肿等现象。
如为多次给受试物实验则一般每日涂抹一次，连续一周， 其余均与一次给受试物的方法和要求一致。
2、结果判断与评价
每只动物实验结果按表1进行刺激反应评分，
计算出平均分值按表2进行刺激强度评价：
表1 皮肤刺激反应评分
红斑形成
无红斑 勉强可见 明显红斑 中等-严重红斑
急性毒性试验
试诉新药临床前安全性评价的内容
1.试诉新药临床前安全性评价的内容。
答：新药临床前安全性评价的内容分为两大类，一是一般毒性试验，二是特殊毒性试验.所谓特殊毒性试验，是指以观察和测定新药能否会引起某种或某些特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验，即此类毒件试验观测的毒性指标是明确的。
广义的特殊毒性试验包含的面比较广。
如遗传毒性试验、生殖毒性试验、依赖性毒性试验、过敏性试验、局部刺激性试验、免疫毒性试验、眼毒试验、耳毒试验及致癌试验等，而狭义的特殊毒性主要是指遗传毒性、生殖毒性和致癌性,即—般常说的“三致”试验.所谓一般毒性试验，是指那些不以观察和测定某种特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验，这意味着观测的毒性指标具有广谱性和不确定性的特点、包括生理学、血液学、血液生化及病理形态学等多方面的综合性指标。
如用不同种属的动物及不同给药途径进行的急性毒性试验、反复多次给药的长期毒性试验.一般药理学试验，是观察新药在一定的剂量条件下，除了主要药效学以外的对机体各系统的影响，国外称为安全性药理试验，理所当然的属于安全性研究的内容，我们国家的新药审评办法，对一般药理试验的要求比较简单,仅要求观察药物对神经、心血管及呼吸系统的影响，而且各系统的试验观察指标也很有限。
另外，除了一般常用的口服、肌内注射、皮下注射、静脉注射途径外,新开发的结药途径及其剂型,其安全性试验的内容,陈了一般性的要求外,尚应根据其具体特点设计能说明问题的毒性试验。
2、试述新药安全性评价的局限性。
答:临床前毒理学评价的基本手段是动物试验，动物实验的第一个局限是而动物由于缺乏第二信号系统，不能象人一样能述说主观感觉性质的毒性反应,如疼痛、腹胀、视物不清、头晕、头昏、耳鸣、疲乏等，这些反应在动物上是难于发现或者是不可能发现的。
另外，由于生物进化上的差异,致使有的反应只出现于人．有的则只出现于动物。
人和动物共同都出现的反应仅占一部分.动物实验的第二个局限是实验动物的数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量的动物中难以发现。
农药安全性毒理学评价程序
农药安全性毒理学评价程序本程序规定了农药安全性毒理学评价的原则、项目及要求。
本程序适用于在我国申请登记及需要进行安全性评价的各类农药。
一、总则1 在评价农药的安全性时，毒理学方面应考虑以下诸因素1.1 化学名称，化学结构1.2 产品组成（有效成份含量及其他成份含量）1.3 理化性质外观、比重、蒸气压、溶解度、乳化性、悬浮性、相混性、熔点、沸点等。
1.4 一般毒性试验和特殊毒性试验项目，依此划分为四个阶段，可根据申请登记的农药类别及有规定进行相应试验。
1.5 每人每日容许摄入量的规定根据动物试验中最大无作用计量，按下列公式计算每人每日容许摄入量（ADI)mg/kg体重=最大无作用剂量（mg/kg)/安全系数。
根据农药的性质及其他因素确定安全系数，一般为100。
每人每日容许从食品中摄入的农药量=ADI(mg/kg)x60(人体标准体重,kg) 最大残留限量(MRL) = ADIx60/1.2（每人每日食品摄入总量）x某种食品所占比例。
如每月食品结构为：谷物12.5公斤，薯类3公斤，干豆1.25公斤，食油0.75公斤，糖类0.5公斤，肉禽类2公斤，鱼0.75公斤，蛋1.0公斤，奶0.75公斤，蔬菜10.0公斤，水果1.5公斤，总计34公斤，每人每日总摄入量则为1.13公斤。
各种食品所占比例为：谷物0.37(36.76%),薯类0.09(8.82%),干豆0.04(3.68%),食油0.02(2.21%),糖类0.01(1.47%),肉禽类0.06(5.88%)，鱼0.02(2.21%),蛋0.03(2.94%),奶0.02(2.21%),蔬菜0.29(29.41%),水果0.04(4.41%)。
1.6 人群接触毒性和意外事故的毒性资料。
开发新品种农药时，对在实验、试产和大田试验阶段的密切接触人员，必须保留完整的健康记录，并定期随访。
申请登记时，递交上述资料。
在新品种农药正式投产和使用的最初阶段（根据具体情况确定年限），设置健康监测点，对包括最密切接触和高危人群在内的观察对象实施健康监测。
药物毒理学生殖毒性试验26 (2)
药物毒理学生殖毒性试验26
药物毒理学的生殖毒性试验可以通过以下的方式进行：
1. 动物试验：常用的动物模型包括小鼠、大鼠、兔子等。
将药物以不同剂量进行口服或注射给予实验动物，观察药
物对动物生殖系统的影响，包括配子形成、生殖腺发育、
性激素水平等指标的变化。
2. 特殊试验：一些特殊试验可用于评估药物的生殖毒性。
例如，通过观察药物对雌性动物的妊娠情况、胚胎发育情
况以及幼儿存活率等指标来评估药物对生殖系统的影响。
3. 体外试验：某些实验也可以在离体细胞培养系统中进行。
例如，使用精子、卵子或培养的胚胎细胞来测试药物对生
殖细胞的影响。
无论采用何种方法，研究人员都应遵守伦理和法律要求，确保试验过程和结果的可靠性和准确性。
特殊毒性实验
哺乳动物 长期致癌试验
长期致癌试验常规选用大鼠和 小鼠，刚离乳的实验动物。设 三个试验组。以最大耐受剂量 （MTD）为高剂量。原则上试验 期限要求长期或终生，一般小 鼠 1.5 年，大鼠 2 年。观察有无 肿瘤出现、肿瘤出现时间及死 亡时间。
(三) 特殊毒性试验
第二节：致癌试验
动物 选择 剂量 分组 途径 期限 结果 分析
大鼠全 胚培养
器官 培养
胚胎细胞 微团培养
水螅 培养
(三) 特殊毒性试验
三段生殖毒性试验
Ⅰ段 Ⅱ段 Ⅲ段
一般生殖毒性试验
致畸试验
围生期毒性试验
（出生后发育）
（生育力和早期胚胎发育） （胚体-胎体）
参考资源
(三) 特殊毒性试验
小鼠骨髓细胞微核试验
Break or loss
(三) 特殊毒性试验
小鼠骨髓细胞微核试验
(三) 特殊毒性试验
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
(三) 特殊毒性试验
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
(三) 特殊毒性试验
第二节：致癌试验
哺乳动物细胞 体外恶性转化试验
体外细胞转化试验是检测受试 物对体外培养的哺乳动物细胞 转化的遗传毒理试验。是将动 物细胞在体外培养的环境下， 将细胞暴露于致癌物，高度模 拟致癌物在体内致癌的作用进 行致癌物检测的一种技术，可 以有效的体外筛查致癌物质的 致癌活性。
传统实验 体外筛选试验 三段生殖毒性试验
(三) 特殊毒性试验
传统实验
动物 选择 剂量 分组 动物 交配 胎仔 检查
结果 评定
大 鼠 家 兔
3剂量组 每组受孕 雌性动物 15-20只
1:1或1:2 大鼠第6天 给受试物 持续到第 15天
毒理学评价的四个阶段和内容
毒理学评价的四个阶段和内容通常包括以下：
1. 急性毒性试验（Acute Toxicity Testing）：
这是毒理学评价的第一阶段，主要目的是确定物质在短时间内（通常是一次或几次接触后）对生物体产生的有害效应。
内容包括：经口、皮肤接触和吸入途径的急性毒性试验，计算LD50（半数致死剂量），即导致一半实验动物死亡的剂量。
2. 遗传毒性试验（Genotoxicity Testing）：
这个阶段评估物质是否能够引起遗传物质（DNA）的损伤，这可能导致突变、癌症或其他遗传疾病。
内容包括：Ames试验（细菌回复突变试验）、染色体畸变试验和微核试验等。
3. 亚慢性毒性试验（Subchronic T oxicity Testing）：
在这个阶段，物质的毒性效应在较长时间内（几周到几个月）被研究。
内容包括：重复剂量毒性试验，观察动物的行为变化、体重变化、血液学参数、生化指标、器官重量和病理学改变等。
4. 慢性毒性试验和致癌性试验（Chronic T oxicity and Carcinogenicity Testing）：
这是最长的一个试验阶段，通常持续数月到数年，旨在评估物质长期暴露对生物体的影响，包括潜在的致癌性。
内容包括：生命周期研究，观察生长发育、生殖能力、寿命以及肿瘤发生率等。
在这些试验中，除了直接的毒性效应外，还会考虑物质的代谢途径、蓄积效
应、剂量-反应关系以及敏感群体（如孕妇、儿童和老人）的特殊反应。
这些信息对于全面评估物质的安全性和风险管理至关重要。
值得注意的是，具体的试验设计和要求可能会根据监管机构的指导原则和物质的特性进行调整。
特殊毒性作用及其试验与评价方法
暴露条件
暴露浓度与暴露时间
有毒物质的暴露浓度和暴露时间直接影响其毒性作用的大小。
暴露途径
有毒物质的暴露途径（如吸入、食入、皮肤接触等）不同，其毒性 作用也不同。
个体差异
不同生物个体对有毒物质的敏感性和耐受性存在差异，因此相同暴 露条件下，不同个体所受的毒性作用也不同。
05 特殊毒性作用的预防与控 制
个体防护
提供合格的个人防护用品
为员工提供合格的个人防护用品，如化学防护眼镜、化学防护服、 化学防护手套等。
定期进行健康检查
定期对员工进行健康检查，及时发现和处理职业病和职业相关疾病。
加强员工安全培训和教育
加强员工的安全培训和教育，提高员工的安全意识和自我保护能力。
06 未来研究方向与展望
加强基础研究
通过检测受试物对体外培养细胞 的毒性作用，以评估受试物的细 胞毒性。
02
生殖细胞致突变试 验
通过检测受试物对生殖细胞的致 突变作用，以评估受试物的遗传 毒性。
03
致癌试验
通过检测受试物对动物或人体细 胞的致癌作用，以评估受试物的 致癌性。
整体动物试验
发育毒性试验
通过观察受孕动物在孕期接触受试物后对胎 儿的毒性作用，以评估受试物的发育毒性。
风险管理
制定相应的措施来控制有害物质的暴 露，降低其对人群和生态环境的危害。
风险交流
加强公众对有害物质的认识，提高风 险意识，促进社会共同参与风险管理。
04 特殊毒性作用的影响因素
物质特性
化学结构
某些化学物质具有特殊的化学结构，使其具有 潜在的毒性作用。
溶解度与分散性
物质的溶解度和分散性影响其在环境中的分布 和生物可利用性，从而影响其毒性作用。
新药药理学：特殊毒性试验
药物依赖性试验
❖ 催促试验：在短时间给予动物大剂量受试药，然后 注射受体对抗剂观察和记录是否出现戒断症状及其 严重程度。此法只适用于有竞争对抗剂的阿片类药 物
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
❖ 诱导试验：大部分镇静催眠药无竞争性受体对抗剂， 可采用诱导试验。通过应用各种诱发惊厥的方法， 只采用阈下刺激强度，对正常动物不引起惊厥反应， 对镇静催眠药产生依赖性的动物，在断药期间出现 反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥
药物依赖性试验
❖ 镇痛药：自然戒断/替代试验以及催促试验 ❖ 镇静催眠药：自然戒断/替代试验以及诱导试
药物依赖性
❖ 依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性
❖ 躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所产 生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症 状
❖ 精神依赖性是药物对中枢神经系统作用所产生的一 种特殊的精神效应，表现为对药物的强烈渴求和强 迫性觅药行为
身体依赖性试验
❖ 自然戒断试验：连续给予动物一段时间的受试药后， 突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的代 表药物做对比，按照戒断症状和严重程度判断受试 药的依赖性潜力
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前致癌物 (precarcinogen) 不直接致癌，必须在体内经代谢转化， 其代谢产物才具致癌作用的化合物
近致癌物 (proximate carcinogen) 前致癌物经代谢活化过程形成一种或一 系列中间代谢产物，必须经进一步代谢活化， 才能形成终致癌物 终致癌物 (ultimate carcinogen) 直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所 形成的具有致癌作用的代谢物的统称
阴性结果：意义较差
二、哺乳动物长期致癌试验
(一) 动物选择 易感性是选择动物最重要依据 物种：特定靶器官 品系： 年龄：刚断乳 性别：雌雄各半 数量：各50只
（二）剂量设计 一般设3个染毒剂量组和1个对照组， 必要时另设一个溶剂对照组。3个染毒 剂量组包括无作用剂量组、阈剂量组、
（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因
1．癌基因 (oncogene) 在自然或实验条件下具有诱发恶性转化 的潜在基因，是化学致癌物作用的主要靶分 子，在细胞癌变过程中起着关键作用
是一类被激活的基因，所指导合成的蛋 白质能够促成细胞恶性表型的形成
原癌基因 (proto-oncogene) 机体内正常细胞所具有的能致癌的遗 传信息。正常情况下它呈静止状态，对细 胞无害且具有重要生物学功能（调控细胞 生长分化，促进细胞分裂、增殖等） 原癌基因在进化过程中高度保守
肿瘤流行病学研究
限定为一个而不是全部器官和组织
常用的哺乳动物短期致癌试验
小鼠肺肿瘤诱发试验
小鼠皮肤肿瘤诱发试验 雌性大鼠乳腺癌诱发试验 大鼠肝转变灶试验
在给予受试物后，多次持续给予促长剂
阳性结果：与长期动物致癌试验相当。 由于试验期较短，又未检查其他器官和系 统，特别是皮肤肿瘤和乳腺癌的诱发试验 似乎仅适用于较小范围的化学物质
(2) 内分泌调控剂 主要改变内分泌系统平衡及细胞正 常分化，常起促长剂作用。如乙烯雌酚、 雌二醇、硫脲 (3) 免疫抑制剂 主要对病毒诱导的恶性转化起增强作 用。如嘌呤同型物
(4) 细胞毒剂 可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃 及癌发展。如次氮基三乙酸、氯仿 (5) 过氧化物酶体增殖剂 可导致细胞内氧自由基过量生成。如祛 脂乙酯、邻苯二甲酸乙基己酯 (6) 固态物质 物理状态是关键性因素，可能涉及细胞 毒性。如塑料、石棉
观察内容：生长自控能力、细胞形态、 细胞生长能力、生化表型以及移植于动物 体内形成肿瘤的能力等
应用于细胞转化试验的细胞 原代细胞：叙利亚仓鼠胚胎细胞 (SHE细胞)、 人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮 细胞等
细胞系：BALB/C-3T3，C3H10T1/2和 BHK-21 病毒感染细胞：RLV/RE细胞(劳舍尔白血病 病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞)和SA7/SHE 细胞 (猿猴腺病毒感染的SHE细胞)
国际环境致突变物致癌物防护委员会 (ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传 学终点分为5类 DNA完整性的改变
DNA重排或交换
DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变
（二）细胞转化试验
受试物与正常细胞在体外接触，如有 致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生 变化，发生与癌细胞相似的过程
化学致癌物
(chemical carcinogen) 凡能引起动物和人类肿瘤、增加其发 病率或死亡率的化合物 化学致癌作用 (chemical carcinogenesis) 化学致癌物在体内引起肿瘤的过程
第一节
化学致癌的制
一、与致癌作用有关的代谢
前致癌物
代谢酶 近致癌物 代谢酶 终致癌物 多态性 多态性
具有引发作用的化学物质
2．促长阶段 促进引发形成肿瘤细胞分裂生长的作用阶段 引发物作用之后，促癌物长期、慢性作用 引发物单独作用一般不会引起肿瘤
只有促癌物的慢性作用不会引起肿瘤
引发物与促长物的作用有先后次序 引发作用不可逆，促长在早期可逆
具有促长作用的化学物质，称为促长剂 (promotor)
两个物种，两种性别，至少三个剂量水 平且其中一个接近最大耐受量 每组有效动物数至少50只（动物数量 与其自发肿瘤率成正比）
三、人群流行病学调查
动物致癌试验，根据阳性结果 检出潜在的人类致癌物 描述流行病学调查或临床观察 发现怀疑人类致癌物 病例-对照研究 队列研究
四、致癌作用模型
3. 未分类 二恶烷、美舍吡伦
助致癌物（cocarcinogens）：不具有
引发和促长作用，但可以促进引发作用和 增强促长作用，即能促进或增强全部致癌 过程 。如乙醇、二氧化硫
第三节 观察化学毒物致癌作用的 基本方法
化学致癌物的判别 人群流行病学调查：两项以上由不同 研究者在不同地点、不同对象中以不同 调查方法获得的结论相符的证据； 动物实验证据：两项按现行常规设计 进行，符合GLP（good laboratory practice），在不同物种动物中所得结 果一致的动物致癌物鉴定资料。
二、根据致癌物作用机制的分类
1．遗传毒性致癌物 （genotoxic carcinogens）
与DNA共价结合，引起机体遗传物质 改变，导致癌变的化学物质
占化学致癌物的大多数 可利用遗传毒理学试验来检测
直接致癌物（direct careinogens）： 在体内不需要经过代谢活化即可致癌 间接致癌物（indirect careinogens）： 在体内经代谢转化，其产物具致癌作用 无机致癌物：亲电子剂或通过选择性改 变DNA复制保真性，导致DNA的改变
化学致癌物的判别 定性判别：受试物能否致癌； 定量判别：剂量-反应关系分析 致癌物判别方法 短期试验；
动物致癌试验；
人类流行病学调查
一、短期试验
（一）致突变试验 依据是致突变性与致癌性相联系 对致癌物的筛选需一组致突变试验，最 好每一遗传学终点均有一个试验 若一项阳性，即可认为该受试物为致突 变物，因而就可能是遗传毒性致癌物
部分致癌物用目前常用致突变试验不 能检出其致突变性
常见的非遗传毒性致癌物：石棉、激
素、免疫抑制剂、多氯联苯等
非遗传毒性致癌机制 细胞间隙连接通讯 （gap junction intracellular communication，GJIC）
信号传导系统
纺锤丝系统
DNA修复系统
转基因动物 (transgenic animal)
借助基因工程技术将确定的外源基因通 过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色 体上，在其基因组内稳定地整合经导入的外 源基因，并能遗传给后代的一类动物
基因敲除小鼠 将小鼠基因组中特定内源基因定点突变 的小鼠
1．肿瘤演进模型 引起肿瘤的小鼠，可建立在某一基因的 突变与导致肿瘤的细胞内变化间的直接因果 性联系的试验模型。转基因小鼠发生的肿瘤 在发展的过程中可识别其组织学改变，通过 识别在该过程每个阶段发生的遗传学变化， 不仅可以分析单个基因的功能，而且可以将 肿瘤发展中的遗传学事件排序
致癌毒性试验
肿瘤(tumor，neoplasm) ：有分裂潜能的细胞 受致癌因素作用后发生恶性转化和克隆性增生 所形成的新生物
良性肿瘤：呈膨胀生长，与周围组织有明显的 界限，多有包膜，它们生长常有“自限性”， 对机体破坏较小 恶性肿瘤：癌和肉瘤 癌(carcinoma)：由上皮细胞来源的恶性肿瘤 肉瘤(sarcoma)：由间质细胞来源的恶性肿瘤
发生肿瘤的剂量组（此为最高剂量组），
以求出明确的剂量反应关系
（三）试验期限与染毒时间 原则上试验期限要求长期或终生。 致癌试验通常与慢性毒性试验结合起来 进行 小鼠最少1.5年 大鼠2年
（四）结果的观察、分析和评定 致癌试验常用的指标 1．肿瘤发生率
2．多发性 3．潜伏期
注意事项 对于阴性结果的认定应非常慎重
3．进展阶段
在促进之中或之后， 细胞表现出不可逆的遗传 学改变，其标志为遗传不 稳定性增加和恶性变化， 在形态上或功能代谢和行 为方面逐渐表现出肿瘤的 特征，如生长速度、侵袭 性、转移能力及生化、免 疫性能改变
分化 程度 高
低 表皮干细胞的分化
图8-1 多阶段致癌理论图解
四、非遗传毒性致癌机制
基因表达调控系统
第二节
化学致癌物的分类
化学致癌物的分类
组1，对人类是致癌物，87种； 组2，对人类是很可能或可能致癌物 组2A，对人类很可能是致癌物，63种； 组2B，对人类是可能致癌物，234种；
组3，现有证据不能对人类致癌性进行分类，
493种； 组4，对人类可能是非致癌物，1种
（四）基因表达调控异常与肿瘤发生 基因学说：癌变是由于基因的改变 基因外学说：基因表达调控失常 理论统一
三、化学致癌过程
引发阶段 (initiation)
促长阶段 (promotion)
进展阶段 (progression)
1．引发阶段 / 启动阶段 突变细胞（启动细胞，initiated cell） 致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经 细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细 胞发生永久性、不可逆的遗传性改变 引发剂（启动剂，initiator）
2．肿瘤病因、发病机制研究
建立携带有肿瘤基因的转基因动物
具有四维特征，能够从空间和时间角 度同时观察目的基因的活动情况。可以检 测一些已知的癌基因或抑癌基因的改变在 肿瘤发生中的作用，帮助识别其他影响肿 瘤发生的基因
致癌物评价程序
化学物的结构分析
短期致突变试验
短期动物致癌试验
长期动物致癌试验
二、化学致癌作用的分子机制
（一）DNA加合物 有致癌活性的终致癌物，含有亲电子 结构基团的化合物，它能与细胞靶分子发 生共价结合，形成加合物使这些生物大分 子烷基化，导致DNA的突变 接触环境致癌物的标志