环境生物学实验指导书

实验一普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察

一、实验目的

1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。

2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。

3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。

二、实验原理

普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。

图1-1 双目生物显微镜

1．机械部分：

（1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。

（2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。

（3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。

（4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。

2．光学部分：

（1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。

（2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是

N ）及所要求盖玻片显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（A

厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。

（3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。

（4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。

三、实验器材

1．普通光学显微镜（双目生物显微镜）

2．载玻片、盖玻片若干

3．玻璃棒、滴管

4．滤纸、擦镜纸

5．藻类、酵母培养液，新鲜活性污泥

四、实验方法

１．低倍镜的操作

（１）首先把目镜放入镜筒上，将物镜（4、10、40、100）旋紧在转换器上。

（2）标本放在载物台上，用玻片夹持器挟紧。并用移动手轮移动所要观察的目的物到圆孔的正中央。

（３）打开电源开关，调整聚光器，使光路对准载物台中央的光孔，光亮度要适宜。

（４）旋动转换器，将10倍物镜对准光孔。

（5）用粗调焦手轮使物镜与标本距离至最小，同时要侧脸观察，以免压坏标本玻片或损坏物镜。

（6）调节瞳距。

（7）眼睛接近目镜观察，左（右）手用移动手轮轻轻移动玻片夹持器，右（左）手用粗调焦手轮将载物台下移（向内旋转调焦手轮），如果见到目的物，但不是十分清楚，再用细调焦手轮调节，至目的物清晰为止。

（8）如果粗调焦手轮旋得太快，超过焦点，必须从第（5）步重调，不要在正视目镜的情况下调粗调手轮，防止没有把握的旋转使物镜与载玻片相撞碰坏。

注：观察时两眼同时睁开，双眼不感觉疲劳。

2．高倍镜的操作

（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察（操作方法同低倍镜的操作）。

（2）旋动转换器，换用高倍镜（40）观察，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜观察没有调准焦距，目的物没有找到，须用低倍镜重新调节。如果调节正确，换用高倍镜时基本可以看到目的物，如果模糊，用微调焦手轮稍微调节一下就清晰可见。

3．微生物形态观察

取一干净的载玻片，用滴管或玻璃棒在培养液内沾一滴菌液，用干净的盖玻片覆盖在滴液上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察。记录微生物的形态特征。

四、实验记录及结果

表1-1微生物的形态观察记录

五、思考题

1．镜检标本时，为什么要先用低倍物镜观察？

2．画一个细胞结构的示意图。

实验二微生物的计数（酵母菌的显微镜直接计数）

一、实验目的

1．了解并掌握常用的血球计数板的构造。

2．学会一般的显微镜直接计数方法。

二、实验原理

测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petroff Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图2-1）。每个方格网共分9大格，其中间的一大格（称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图2-2）。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的间隙为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

图2-1 血球计数扳的构造

a.平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网)） 图2-2 血球计数板计数网的分区和分格

b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有0.1毫米的间隙）

三、实验器材

1．双目生物显微镜1台 2．血球计数板1块 3．新鲜酵母培养液

4．盖玻片、擦镜纸、滤纸

四、实验方法

1．取洁净的血球计数板一块。

2．将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

3．静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

4．计数时用16中格的计数板，按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板，除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调手轮，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

5．凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2次，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含菌数＝8080小格内总数

×400×10×1000×（稀释倍数）

6．血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格

刻度。洗净后自行晾干。