植物激素的检测方法

植物激素的检测方法

摘要：植物激素是植物体内的微量信号分子，它们几乎调节着植物生长发育的所有过程，植物，植物激素的检测常用方法有

关键词：植物激素的检测；生物试法；色谱检测法；免疫检测法

1 植物激素的介绍

植物激素是指植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质。

植物激素有六大类：即生长素（auxin）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethyne，ETH）和油菜素甾醇（brassinosteroid，BR）。它们都是些简单的小分子有机化合物，但它们的生理效应却非常复杂、多样。

2 植物激素检测方法研究

2.1 生物试法

生物试法是最早检测植物激素的方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特异性反应来进行检测。

1928年F W Went首先建立了检测植物生长素的燕麦芽鞘弯曲测试法,但方法复杂,若没有熟练的技巧,就很难取得准确的结果。因此在1933年, Thimann K V 和J Bonner把这个方法改变了一下建立了燕麦叶鞘切断伸长法,简化了操作方法。此后,随着ABA、CTK、GA等激素的逐一发现,相应的各类激素的测定方法也被广泛建立。例如,小麦胚芽鞘切断抑制法检测ABA;烟草髓愈伤组织鉴定法和胡萝卜根愈伤组织鉴定法鉴定CTK;矮生豌豆法、大麦胚芽鉴定法和点滴法鉴定GAs等等[1]。生物试法具有简便易行的特点，能够反应植物激素的生理活性，还可以鉴定新的植物激素和生理活性物质，因此至今仍然得到广泛的应用。但其不足之处在于，植物体内往往存在许多激素分子的类似物、代谢物、拮抗物或其他干扰物质，从而影响生物试法的检测结果[2]。此外还要尽量控制环境因子和使用的植物材料的均一性，以便检测结果的准确、可靠。

20世纪90年代Wout Boerjan[3]等建立的重组DNA技术定量检测生长素和细胞分裂素的方法可谓是这一领域的一个重要进展。这一方法主要利用生长素和细胞分裂素诱导构建Pg5-GUS基因表达,通过测量表达产物定量检测IAA和CTK建立起来的,其检测灵敏度为IAA达5×10-8mol,反ZT达5×10-11mol。此法不象经典的生物试法那样,只对一种激素专一,它能同时检测生长素和细胞分裂素的活性;此法从分子水平着手,以茎段、胚芽鞘和愈伤组织作为分析材料,细胞更具同源性和一致性。

2.2 生物鉴定法

生物测试法是最早采用的植物激素测定方法，它是利用植物激素的生理活性，通过某些植物的组织和器官对植物激素，产生的特异性反应进行测定的。但

这种方法专一性差，灵敏度地，工作量大，渐渐很少使用。

2.3 色谱检测法

2.3.1 气相色谱法 GC可以用于所有植物激素的分析，但首先要经过甲基化和三甲基硅烷化才可以进行分析。乙烯作为气态激素主要用GC测定。GC 的检测器可分为质量型和浓度型2种，前者包括火焰离子化检测器（FID）和火焰光度检测器（FPD）等；后者包括热导检测器（TCD）和电子捕获检测器（ECD），分析植物激素多用氢焰离子化器。目前，GC与质谱联用的方法在植物激素的检测中已有广泛的应用，而且还可鉴定未知物质的结构，这对于研究新的植物激素具有重要意义，但需经冗长的样品纯化程序，设备昂贵，使用和维护成本高。

2.3.2 液相色谱法目前，HPLC已在除乙烯外的四大类植物激素分析领域中不断地发展应用。色谱柱可分为液-液分配柱、液-固吸附柱、离子交换柱等。检测器也可以有多种选择，常用是紫外检测器。HPLC配合紫外检测器已成为植物内源激素分析的有效手段，它可联合测定植物组织抽提液中的多种内源激素。近年来对液相色谱与质谱联用的应用越来越多，利用质谱作为检测器，弥补了灵敏度的弱点。液质联用是目前植物激素分析的发展趋势。有研究应用反相高效液相色谱与串联电喷雾离子质谱法对ABA进行检测，精确度能达到0.89ng/g，并在0 ～ 1.5ng 间保持线性[4]。

2.4 免疫检测法

放射免疫分析（RIA）和酶联免疫法（ELISA）是植物激素免疫测定测试中最常用的，但是放射性物质会对实验人员有危害。近年来，随着各项分析技术的发展，有报道运用免疫层析技术和液相电喷雾质谱法结合的方法检测植物激素，在专一性和灵敏度方面效果都很好[5]。另有研究植物激素免疫传感器测定方法[6]，利用抗原或抗体作为识别元件，通过抗体培育形成抗体-待测物结合体，由转换器将生物，化学信号转换成电信号，通过适当的方法进行直接或间接地定量检测。这种方法由于利用了抗体抗原建的高亲和性，因此具有很高的灵敏度和选择性。免疫学方法与生物测试法相比不仅提高了检测灵敏度,可检测出10-12g的微量物质,相应其前处理也得到了简化,又改善了测定的专一性,但抗体的制备较复杂,尤其分子量小的植物激素本身为半抗原,须与牛血清蛋白等偶联后才能作抗原,且激素的同系物、前体、类似物以及其他性质不明的化合物等存在不可避免地会出现交叉反应。现有人采用单克隆抗体技术(mAb)[7]生产免疫测定中所需的抗体,解决了免疫测定中所使用抗体的多克隆性,提高了抗体的专一性。酶联免疫技术也常和物理化学方法联用[8]。到目前为止,除乙烯外,其余四大类激素的RIA和ELISA检测方法均已建立,并有成套的药盒出售。

小结：

在上诉的几种测定方法，电化学方法也不断地被应用于植物激素的测定中。如Lee等[9]首次报道了采用α,β,γ环糊精(CD)为添加剂的毛细管区带电泳对吲

哚乙酸、2, 4, 5三氯酚乙酸等多种植物激素的分离,具有高效、快速、样品预处理简单、进样量少的特点。最近,湖南植物激素重点实验室与湖南大学联合研制的吲哚乙酸免疫传感器是继色谱、质谱及其联用、酶联免疫及放射免疫之后,在植物激素测定方法领域的重大创新与突破[10]。此法不仅灵敏度高,而且有实现实时

化、连续化和自动化测试的潜力,可能发展为一种测定植物激素的新型技术平台。

总体而言，近几年来随着检测仪器的不断推陈出新，各类植物激素的分析检测方法己得到了很快的发展，一定程度上也促进了植物激素作用机理的研究。

参考文献：

[1]增田芳雄,胜见允行,今关英雅等.辽宁铁岭农学院《植物激素》翻译小组译.植物激素[M] .北京:科学出版社,1972.

[2]何瑞.曹玉广.植物生长调节剂使用中的安全问题.中国卫生监督杂志,2003,10

(2) :99~101.

[3]Wount Boerjan et al.A new bioassay for auxins and cytokinins [J] .Plant Physiology, 1992, 99: 1090～1098

[4]Ross, et al. Detemination of endogenous and supplied deuterated abscisic acid in plant tissures by HPLC-ESI-MSn. Analytical Biochemistry[J].2004，329（2）:324-333.

[5] V.Hradech,etal.Immunoaffinity chromatography of abscisic acid combined with HPLC-ESI-MSn.Journal of Chromatography[J].2007,vol.847（2）:162-173.

[6] J.Li,et al.A novel piezoelectric biosensor for the detection of phytohormones indole acetic acid.Analytical Sciences[J].The Japan Society for Analytical Sciences,2002,18（1）:1-5.

[7]吴颂如,陈婉芬,周燮.酶联免疫法(ELISA)测定内源植物激素[J] .植物生理学通讯, 1988 (5): 53～57

[8]Zheng Z F,et al.A Monoclonal antibody recognizing nonderivative

13-hydroxy gibberllins and their glucosides.

[9] Yeo S K,Lee HK,et al.Separation of plant growth regulators by capillary electrophoresis[J].J of Chromatogr,1992,594: 335～340.

[10] Jin Li,Zhao-Yang Wu,Lang-Tao Xiao et al.A novel piezoelectric biosensor for the detection of phytohormoneβ-indole acetic acid [J] .Analytical Sciences (The Japan Society for Analytical Sciences), 2002, 18 (1): 1～5