酶学与酶工程第六章酶的固定化
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酶学与酶工程第六章酶的固定化
2) 共价结合法
共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和 载体的功能基团进行偶联的固定化方法。
载体有：天然高分子衍生物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼 脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、 乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龙等
酶学与酶工程第六章酶的固定化
于反复使用 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或
反应液发生化学反应 固定化酶成本要低，以利于工业使用
酶学与酶工程第六章酶的固定化
三、固定化方法
酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载 体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
固定化方法有很多，但对任何酶都适用的方法是没 有的，必须经过试验研究才能确定。
酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、结合法、 交联法和热处理法。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上， 而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
重氮法时要注意载体的亲水性与疏水性， 严格控制反应条件，提高反应的专一性，例如使反应
局限于α-氨基，保护ε-氨基， 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与
必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
2）微胶囊法 微胶囊固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球
状体，比凝胶包埋颗粒要小得多，底物和产物扩散 阻力较小，但是反应条件要求高，制备成本也高。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
3. 结合法
选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起 的固定化方法称为结合法。可分为离子键结合法，共价键 结合法两种。
固定化酶优点：
极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺； 可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应，酶的使用效
率提高，成本降低； 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 酶反应过程能够加以严格控制； 较游离酶更适合于多酶反应； 可以增加产物的收率，提高产物的质量。 。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
第六章 酶、细胞、原生质 体的固定化
酶学与酶工程第六章酶的固定化
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme） 1. 定义：固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化
学的方法处理，使之成为不溶于水的，但是仍具 有生物活性的酶。催化反应后的酶可以回收重复 使用。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用
于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢 固而容易脱落，
酶学与酶工程第六章酶的固定化
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方 法称为包埋法。
包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包
缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了 比较激烈的反应条件，可能会引起酶蛋白高级结构的变化， 破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化 酶，其酶活回收率一股为30％左右，有时甚至底物的专 一性等酶的性质也会因固定化而发生变化
酶学与酶工程第六章酶的固定化
保护措施： 应选择适宜的固定化方法与相应的载体，例如，采用
埋法； 将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶
芳香烃化反应：含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯均 三嗪等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚 基或巯基等偶联。
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叠氮反应：适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM—纤 维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯－顺丁烯二酸酐共聚物等。
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共价结合法的优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般 不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，这有利 于连续使用
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1）离子键结合法 在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具
有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法，因而也称离 子交换吸附法。 离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高 级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活 回收率高的固定化酶。 缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或 pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往 会从载体上脱落。
酶和载体的偶联反应有多种，取决于载体上的功能基团 与酶分子上的非必需侧链基团。
载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有 直接反应的能力，所以要通过两类方法来解决：一是将载 体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一 种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
固定化酶的缺点： 由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收
率损失； 由于固定化需用载体，因而多了载体成本费及固定化操
作费用； 固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降； 只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。
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二、固定化酶的制备原则
必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化 应有最小的空间位阻 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利
重氮反应 是带芳香氨基的水不溶性载体的主要反应，载体在稀盐酸和亚硝
酸钠中进行反应，成为重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和 酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基直接进行偶联
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溴化氰法：对于带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖 等来说，这是最常用的反应。
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2) 共价结合法
共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和 载体的功能基团进行偶联的固定化方法。
载体有：天然高分子衍生物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼 脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、 乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龙等
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于反复使用 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或
反应液发生化学反应 固定化酶成本要低，以利于工业使用
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三、固定化方法
酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载 体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
固定化方法有很多，但对任何酶都适用的方法是没 有的，必须经过试验研究才能确定。
酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、结合法、 交联法和热处理法。
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1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上， 而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
重氮法时要注意载体的亲水性与疏水性， 严格控制反应条件，提高反应的专一性，例如使反应
局限于α-氨基，保护ε-氨基， 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与
必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
2）微胶囊法 微胶囊固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球
状体，比凝胶包埋颗粒要小得多，底物和产物扩散 阻力较小，但是反应条件要求高，制备成本也高。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
3. 结合法
选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起 的固定化方法称为结合法。可分为离子键结合法，共价键 结合法两种。
固定化酶优点：
极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺； 可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应，酶的使用效
率提高，成本降低； 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 酶反应过程能够加以严格控制； 较游离酶更适合于多酶反应； 可以增加产物的收率，提高产物的质量。 。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
第六章 酶、细胞、原生质 体的固定化
酶学与酶工程第六章酶的固定化
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme） 1. 定义：固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化
学的方法处理，使之成为不溶于水的，但是仍具 有生物活性的酶。催化反应后的酶可以回收重复 使用。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用
于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢 固而容易脱落，
酶学与酶工程第六章酶的固定化
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方 法称为包埋法。
包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包
缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了 比较激烈的反应条件，可能会引起酶蛋白高级结构的变化， 破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化 酶，其酶活回收率一股为30％左右，有时甚至底物的专 一性等酶的性质也会因固定化而发生变化
酶学与酶工程第六章酶的固定化
保护措施： 应选择适宜的固定化方法与相应的载体，例如，采用
埋法； 将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶
芳香烃化反应：含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯均 三嗪等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚 基或巯基等偶联。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
叠氮反应：适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM—纤 维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯－顺丁烯二酸酐共聚物等。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
共价结合法的优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般 不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，这有利 于连续使用
酶学与酶工程第六章酶的固定化
1）离子键结合法 在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具
有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法，因而也称离 子交换吸附法。 离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高 级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活 回收率高的固定化酶。 缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或 pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往 会从载体上脱落。
酶和载体的偶联反应有多种，取决于载体上的功能基团 与酶分子上的非必需侧链基团。
载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有 直接反应的能力，所以要通过两类方法来解决：一是将载 体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一 种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
固定化酶的缺点： 由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收
率损失； 由于固定化需用载体，因而多了载体成本费及固定化操
作费用； 固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降； 只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。
酶学与酶工程第六章酶的固定化
二、固定化酶的制备原则
必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化 应有最小的空间位阻 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利
重氮反应 是带芳香氨基的水不溶性载体的主要反应，载体在稀盐酸和亚硝
酸钠中进行反应，成为重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和 酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基直接进行偶联
酶学与酶工程第六章酶的固定化
溴化氰法：对于带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖 等来说，这是最常用的反应。
酶学与酶工程第六章酶的固定化