红茶提取物对胰脂肪酶抑制活性的研究

EC1(3.3 g)，EC2(0.82 g)，EC3(1.93 g)，EC4(3.03 g)，EC5(2.41 g)，EC1(3.0 g)上MCI-HP20树脂层析 柱，20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液 洗脱，得到EC1-1(0.43 g)，EC1-2(1.79 g)，EC13(0.53 g)，EC1-4(0.10 g)，EC1-5(0.02 g)；EC3(1.9 g)上MCI-HP20树脂层析柱，20%、40%、60%、 80%、100%甲醇水溶液洗脱，得到EC3-1(0.48 g)，EC3-2(0.38 g)，EC3-3(0.68 g)，EC3-4(0.15 g)，EC3-5(0.16 g)；EC4(2.8 g)上MCI-HP20树脂层 析柱，20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液 洗脱，得到EC4-1(0.39 g)，EC4-2(0.09 g)，EC43(1.09g)，EC4-4(0.44 g)，EC4-5(0.68 g)。 1.2.2 胰脂肪酶抑制活性测定 胰脂肪酶活性的 测定采用对硝基苯酚法 [10-13]，根据实验情况进一 步优化。调节恒温箱至37 ℃，取0.05 mol/L TrisHCl缓冲液(pH=8.0)700、100 μL酶液(0.5 mg/mL)， 100 μL抑制剂，置恒温箱内预热15 min，然后注 入100 μL底物溶液(0.01 mol/L)，震荡15 min，立 即加入沸水终止实验，冷却后用分光光度计在405 nm波长下测其吸光度，以蒸馏水代替酶液为空白 对照。 酶活性抑制率(%)=[(AE-AI)/AE]×100 式中：AE为不加抑制剂时405 nm的OD值； AI为加入抑制剂样品后在405 nm处的 OD值。 1.2.3 Folin-Ciocalteu比色法测定红茶提取物多酚 含量 采用Folin-Ciocalteu比色法[14-17]测定红茶胰 脂肪酶活性部位中的总多酚含量。分别取1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准没食子酸溶液(45 μg/ mL)，加入2.0 mL 1 mol/L FC试剂，7.5 mL 15%碳 酸钠溶液，参比为2.0 mL FC试剂＋7.5 mL碳酸钠 溶液，均定容至25 mL的棕色容量瓶中，反应温 度为30 ℃、显色1 h，在760 nm下测定各溶液的吸 光度。以标准品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制标准曲线，得标准方程。 取1.0 mL 1 mg/mL待测样品同样方法下，以2.0 mL FC试剂＋7.5 mL碳酸钠溶液作为空白对照， 760 nm波长处测定样品溶液的吸光度。根据标准 曲线标定浓度，计算总多酚含量。 1.2.4 UPLC法测定红茶各部位中的咖啡因含量 采用UPLC法[18-19]测定红茶中胰脂肪酶抑制活 性部位中的咖啡因含量。色谱条件：检测波长280 nm，B相(乙腈)，D相(水-0.5%甲酸)，以梯度洗脱 的方式分离测定红茶各部位，梯度洗脱程序为0~3
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胰脂肪酶又称为甘油三酯水解酶，是水解膳 食脂肪最重要的酶类，可将50%~70%的食物脂肪 降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸被人 体吸收[1]。因此抑制它的活性是预防肥胖的有效途 径之一。绿茶、乌龙茶、红茶、普洱茶等在降血 脂、降血糖、减肥作用均有报道[2-5]，白茶、绿茶
多酚[6]，乌龙茶中的茶黄素[7]等成分，是抑制胰脂 肪酶的活性成分，特是绿茶中的EGCG[8]，还对肥 胖老鼠有减重作用。 红茶是发酵茶，其主要成分有茶多酚、咖 啡因、茶氨酸等不同类型化合物，其中的茶多酚 与绿茶中的多酚成分有显著差别，经酶发酵处理
表2 样品中总多酚和咖啡因的含量
样品 水部位 氯仿部位 石油醚部位 醇部位 乙酸乙酯部位 EC1 EC2 EC3 EC4 EC5 EC1-1 EC1-2 EC1-3 EC1-4 EC1-5 EC3-1 EC3-2 EC3-3 EC3-4 EC3-5 EC4-1 EC4-2 EC4-3 EC4-4 EC4-5 奥利斯他
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.08.047
Inhibitory effects of black tea on panreatic lipases
YANG Long-jia, WANG Jin, YANG Qing-xiong*
(School of Chemistry and Material Science, Guizhou Normal University, Guiyang 550001)
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提取物与应用
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min，3%~12%乙腈，流速0.30 mL/min；3~4 min， 12%~13%乙腈，流速0.15 mL/min；4~14 min， 13%~17%乙腈，流速0.15 mL/min；14~30 min， 17%~28%乙腈，流速0.15 mL/min；柱温：25 ℃， 进样体积2.0 mL。 精确吸取1.0 mg/mL咖啡因母液0.1、0.2、 0.6、1.0、1.4 mL，于2 mL容量瓶中。再加甲醇至 刻度处，摇匀，并用0.20 μm微孔针头过滤器过 滤，按上述UPLC检测条件进行分析，绘制咖啡 因的标准曲线，得标准方程。取待测样品溶液2.0 mL，经0.20 μm滤膜过来后，置于UPLC样品瓶 中，进样体积2.0 mL，测定UPLC色谱图，根据标 准曲线方程计算咖啡因含量。 2 结果与分析 2.1 红茶胰脂肪酶抑制活性部位筛选
Abstract: Guided by the pancreatic lipase inhibitor activity screening, it was found that the ethyl acetate fraction showed the most potent activity. With different chromatography methods, the active ethyl acetate fraction was separated into active compound caffeine and several active subfractions according to the pancreatic lipase inhibitory screening results. Caffeine and polyphenol were the main active compound in the black tea. The mechanism of the inhibition research on the the active ethyl acetate fraction and the typical components of black tea, caffeine, EGCG and theaflavin indicated that the inhibition reaction was uncompetitive. Key words: black tea extract; panreatic lipases; inhibitors; caffeine; uncompetitive inhibition
*通讯作者 收稿日期：2015-04-13 作者简介：杨龙佳(1988—)，女，河南人，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。
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提取物与应用
后，儿茶素类茶多酚含量降低[9]，经氧化聚合为茶 黄素等深度氧化产物，因而，红茶在很多方面的 特性与绿茶有明显的区别。但红茶对胰脂肪酶的 抑制作用，以及其中的抑制活性成分，尚未有文 献报道。 本文以胰脂肪酶抑制活性筛选为指导，研究 红茶提取物对胰脂肪酶的抑制作用，并通过对其 中各类组分的分析，讨论了红茶对胰脂肪酶抑制 活性的物质基础。 1 实验部分 1.1 实验材料与仪器 红茶：贵州福泉世纪福有限公司；猪胰脂肪 酶、硝基苯基丁酸酯：Sigma公司；对硝基苯酚、 甲酸(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司； 奥利司他：浙江海正药业股份有限公司；三羟甲 基氨基甲烷：上海蓝季科技发展有限公司；二甲 基亚砜：广东光华科技股份有限公司；盐酸：北 京化工有限公司；石油醚、甲醇、乙酸乙酯、 氯仿：分析纯；咖啡因(UPLC≥98%)：实验室制 取；甲醇、乙腈：色谱级，德国Merck公司。 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪 (配二极管阵列检测器、Empower色谱工作站)、 Waters ACQUITY UPLC BEH C 18柱超高效液相色 谱柱(填料粒径1.7 μm，2.1 mm×100 mm不锈钢 柱)：美国Waters公司；Milli-Q超纯水机：德国 Merkmillipore公司；玻璃纤维滤膜(Φ90 mm，孔 径1.6 μm)：英国Whatman公司；微孔针头滤膜 (孔径0.2 μm)：美国Millipore公司；UV-2450型 紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；TW-12 恒温水浴锅：德国JULABO公司；DENVER INSTRUMENT电子天平；UB-7pH酸度计：美国 丹弗公司；微量加样器：德国Eppendorf公司； 旋转蒸发仪：日本EYELA公司。 1.2 实验方法 1.2.1 红茶的提取和分段分离 取红茶500.0 g，粉 碎后，用1000.0 mL甲醇冷浸提取6 h，过滤，收 集滤液，残渣再加1000.0 mL甲醇冷浸提取6 h， 重复提取4次。合并4次的滤液，在50 ℃下减压 浓缩，得甲醇提取物130.5 g。取甲醇提取物100.0 g，有机溶剂萃取后等石油醚部位、氯仿部位、 水部位和乙酸乙酯部位，取乙酸乙酯部位12.4 g，上Sephadex LH-20凝胶层析柱，分别用20%、 40%、60%、80%、100%甲醇水溶液洗脱，得到
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红茶提取物对胰脂肪酶抑制活性的 研究
杨龙佳，王 进，杨庆雄* (贵州师范大学化学与材料科学学院，贵阳 550001)
摘要：以胰脂肪酶抑制活性筛选为指导，发现红茶提取物乙酸乙酯萃取部分为活性最强的活性 部位，再利用色谱方法，对乙酸乙酯部位进行进一步的分段，得到了活性较为集中的小部位以 及主要活性成分咖啡因。通过对不同部位化学组成的分析比较，发现红茶中多酚和咖啡因是其 抑制胰脂肪酶活性的主要成分；乙酸乙酯活性部位及其主要组分咖啡因、EGCG、茶黄素对胰脂 肪酶的抑制作用均为非竞争性抑制。 关键词：红茶提取物；脂肪酶；抑制剂；咖啡因；非竞争性抑制 中图分类号：TS 272.5+2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)08-0212-05
表1 不同样品对胰脂肪酶的抑制活性
结果显示，红茶醇提物经不同极性溶剂分配 分段后，乙酸乙酯部位对胰脂肪酶的抑制活性最 强，乙酸乙酯部位经葡聚糖凝胶层析法分段得到 的20%、60%、80%三段的胰脂肪酶的抑制活性 较为集中，对这3部分进一步通过MCI色谱分离， 得到了进一步的部位，在这些部位中，EC1-2活 性最强，EC1-3其次，在5 mg/mL的浓度下，对胰 脂肪酶的抑制作用均大于50%，而在相同的浓度 下，EC3-3、EC4-3也接近了50%，EC1-1、EC1-4、EC1-5、EC3-1、EC3-2、EC3-4、EC4-1、 EC4-2等部位的抑制率也超过了30%。 为了进一步说明红茶中胰脂肪酶抑制活性的 化学成分，对活性最为集中的一些部位的化学成 分进行了探讨。 2.2 红茶胰脂肪酶抑制活性部位中的总多酚和咖 啡因含量与胰脂肪酶抑制活性的关系 对所得红茶的活性部位进行UPLC分析，得到 各活性部位的UPLC色谱图(图1)，并分别采用Folin 酚比色法和UPLC法分别测定了各部位多酚和咖啡 因的含量(表2)。