生物化学 第2章 蛋白质(2)

目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 3 材料的选择； 蛋白质初步提纯；
2 组织匀浆的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；
5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白 质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋 白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质 特定的折叠结构受到破坏。
600g,3 min.上清 沉淀：细胞核 6000g,8 min.上清 沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体 沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片 沉淀：核糖体亚基
40000g.30 min.上清 100000g.90 min.上清
细胞液
平衡密度梯度离心： 用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下 沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的 密度范围宽于被分离组分的密度。
二 蛋白质一级结构测定 蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质 样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据 考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的 分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋 白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对 该蛋白质进行定量分析。
七肽的顺序为：Trp-Glu-Phe- Met-Ala-Pro-Lys
（七）间接方法测定蛋白质的一级结构： 测定蛋白质基因的顺序可推测蛋白质一级结构。 由于近年来DNA的序列测定相对比较容易，采用测定编码该 蛋白质的基因序列来推断蛋白质一级结构，这种方法适用 于组织中含量低纯化比较困难的蛋白质，其前提条件就是 要能够得到编码该蛋白质的基因。 （八）数据库提供不同蛋白质顺序的信息 在测定一种蛋白质的氨基酸顺序后，按照惯例该蛋白 质的顺序信息就进入到数据库中这些数据以及其它更专门 化的内容可经World Wide Web访问，从而了解到你所需要 的有关数据。
三 蛋白质与生物进化
（一） 蛋白质一级结构与生物进化 以胰岛素和细胞色素c为例说明。示出了细胞色素c 种系发生树。 1 序列比较提供蛋白质结构与功能的信息 同源蛋白质 (homologous proteins)进化上相关 的蛋白质，换句话说，来源不同的同一种蛋白质，例如 细胞色素C、胰岛素，在不同生物体内存在的的同一种蛋 白质。
（五）肽碎片的氨基酸顺序分析： Edman降解法：专用试剂是苯异硫氰酸。 羧肽酶法： 羧肽酶 A：从C-末端依次降解末端残基，含芳香环的或脂肪烃基 较大的残基易被水解。但该酶不能水解C-末端的 Arg、Lys 和 Pro。羧肽酶 B能专门水解C-末端的 Arg 和 Lys，对其它残基不 起作用。如果C-末端第二个残基是Pro，则酶 A 和酶 B 都不起 作用。羧肽酶 C能水解C-末端的 Pro. （六）片断重叠确定整个肽链的氨基酸顺序： 胰酶：Ala-Arg Arg Met-Phe--Ala-Lys Asp-Phe--Leu-Lys 糜酶：Ala-Arg—Arg--Met-Phe Ala-Lys—Asp-Phe Leu-Lys 全顺序Ala-Arg—Arg--Met-Phe--Ala-Lys—Asp-Phe--Leu-Lys
血红蛋白（hemoglobin,Hb）分子病 分子病是遗传疾病-镰刀状细胞贫血病 血红蛋白异常由基因突变引起，并通过遗传在群体中 散布。
利用电泳比较了HbS(镰刀状细胞贫血病)与正常 的成熟的血红蛋白（HbA）。结果表明Hb S比Hb A带 有的正电荷多，后来序列分析发现，HbS分子中的链 的第六个氨基酸残基是一个非极性的缬氨酸，而正常 的HbA分子中的链的第六个氨基酸残基是谷氨酸，这 一替换是由编码链的基因中的单个核苷酸取代引起 的。
丹磺酰氯分析多 肽链的N－末端
水解多 肽确定 氨基酸 组成
确定N末端的 氨基酸残基
苯异硫氰酸 酯（PITC） Edman试剂
确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。
（三）拆开链间或链内的二硫键 （1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫苏 糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。 （2)氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂， 使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基) 。
活性染色：
根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反 应产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜 色的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂 的蛋白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性 染色法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶 同工酶、谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常 有用。
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹 (Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分 有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体 专一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在, 可以先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上, 然后用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应, 最后可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第 二抗体(通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共 接的酶反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地 检到的目标蛋白。
2 序列比较揭示进化上的关系 细胞色素c存在所有需氧生物种类的细胞中， 该蛋白质在分子水平上提供了从进化上比较生物的一 个非常好的范例。种属越近氨基酸残基序列的相似性 就越大。 （二）基因复制和蛋白质家族 相似功能的蛋白质具有相似的氨基酸序列。基 因复制是进化的一种特别有效的方法，因为一个基因 拷贝通过自然选择进化出新的功能。
（四）肽链的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是 一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰 分别处理所得到的结果：
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Ala—Arg—Arg—Met—Phe—Ala—Lys—Asp--Phe--Leu--Lys
胰酶处理： 凝乳蛋白酶处理： Ala-Arg Ala-Arg-Arg-Met-Phe Arg Ala-Lys-Asp-Phe Asp-Phe-Leu-Lys Asp-Phe-Leu-Lys Leu-Lys Met-Phe-Ala-Lys
差异（速）离心：用不同的离心速度、依据
被分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。
速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液的
顶层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完 成后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区 带分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各 成分都会沉降至管底，而达不到分离效果。
差异（速）离心法
1 胰蛋白酶作用某肽得到非羧基端肽，说明这个肽段 的羧基端残基是赖氨酸。 七肽经酸水解得到Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、 各1 mol，说明Trp被破坏。 2 该肽与DNFB反应后，酸水解得不到任何DNP-aa.说明该肽 的N端为Trp。 3 羧肽酶B作用，不能得到更小的肽说明，C端倒数第二个为 Pro。 Trp--------------------Pro-Lys 4 溴化氰作用得到四肽，Met，Phe和Glu，说明四肽为Trp（Glu，Phe）-Met 三肽为 Ala-Pro-Lys 5 胰凝乳蛋白酶处理得到三肽和四肽，四肽为Ala ，Met， Pro， Lys。显然 三肽的顺序为Trp-Glu-Phe，四肽的顺序为 Met-Ala-Pro-Lys
七 蛋白质的沉降作用及超离心分离
沉降速度(ν = dx / dt )与蛋白质分子的大小 和密度有关。 沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相 近的蛋白质。 沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不 同的蛋白质。 沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时， 单位离心场里的沉降速度。
用离心法分离细胞亚微结构
溴化氰处理： Ala-Arg-Arg-Met Phe-Ala-Lys-
过甲酸
巯基乙醇
碘乙酸
酶法裂解
O NH CH R1 C NH CH R2 O C NH CH R3 O C NH CH R4 O C
水解位点
胰蛋白酶
R1 =Lys或Arg （高度专一,水解速度快） R2 =Pro 不能水解 胰凝乳蛋白酶 R1 =Tyr、Trp、Phe（水解速度快）； Leu、Met或His（水解速度缓慢） R2 =Pro 不能水解 胃蛋白酶 R1 和R2 =Phe、Trp、Try、Leu和其它疏水性氨基酸。 嗜热菌蛋白酶 R2= Leu Ile Phe、Trp、Try Val或 Met R2 =Pro 或Gly不能水解 Pro蛋白酶 Pro——X 溴化氰： R1 = Met （高度专一,水解速度快）
差异（速）离心与平衡密度梯度离心法
第五节
蛋白质的一级结构和测定
（一）蛋白质一级结构概述
蛋白质的结构层次： 一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端 到C端的排列顺序，或称氨基酸序列。
二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿 主轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象 单元。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。
四 完全不同的蛋白质可能来自同一个祖先
母鸡卵清蛋白和人乳α－乳清蛋白之间的序列同源性比 较，表明这两种生物活性和起源完全不同的蛋白质，两者之 间有48个位置的氨基酸残基相同，三级结构非常相似。来自 不同生物体内结构功能相似的蛋白质，可能就是同源蛋白。 因为它们来自同一个祖先基因。
五 蛋白质一级结构的个体差异
第二章蛋白质(protein)(2)
氨基酸与蛋白质的一级结构
（四） 毛细管电泳
毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、 直径为20-75 μm 内经的毛细管里，进行电泳。 优点是分辨率高、、样品需要量小。电泳速度 快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操 作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的 电压进行电泳。 除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析 中使用较为普遍。
三级结构（tertiary structure）： 多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠， 即整个肽链（亚基）的空间形状。三级结构 指的是处于充分折叠、具有生物学活性的一 个完整的球蛋白的三维结构， 。 四级结构（quaternary structure）： 寡聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间 位置。
（一） 氨基酸的组成分析
蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的 组成分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产 生的肽碎片的数目。
（二）末端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽 链的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNSCl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂， 灵敏度比DNFB法高100倍。
例：用胰蛋白酶处理某多肽后获得一个七肽（非羧 基端肽）。这个七肽经盐酸完全水解后获得Met、 Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、各1 mol。该肽与二硝 基氟苯反应后用盐酸水解不能得到任何α－DNP－ 氨基酸。该肽用羧肽酸B处理不能得到任何更小的 肽。该肽用CNBr处理得到一个四肽和一个三肽，四 肽经酸水解后得到Met、Phe和Glu。这个七肽经糜 蛋白酶处理也得到一个三肽和一个四肽，四肽的氨 基酸组成是Ala、Met、Pro和Lys。根据上述信息确 定这个七肽的氨基酸顺序。