外源基因的表达及其优化策略
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第六章外源目的基因表达和调控
质粒拷贝数
(一)大肠杆菌基因表达载体
R
－35 －10
SD
编码序列
TT Tcr Ori
启动子
起始密码子
AUG、GUG、UUG
终止密码子
UAAU、UGA、UAG
大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大 肠杆菌中有效复制的复制子。
启动子
第一节 外源基因表达机制
一、外源基因的起始转录
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选 择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一 个表达系统首先要考虑的问题。
理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表 达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后， 在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始 启动转录，合成mRNA。
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
本底水平转录
lacZ lacY lacA
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
IPTG
三、外源基因mRNA的有效翻译
外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：
1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位 点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9 个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的 二级结构。
第六章 外源目的基因表达与调控
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
策 mRNA的 区
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
基因工程外源基因的工程表达
2. 包涵体存在部位：细胞质、细胞周质
3.包涵体的组成 蛋白质
外源基因的表达产物：占大部分，具有正
确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵 体蛋白一般没有生物学活性。
受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、
核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋 白等。
非蛋白质 ：包括DNA、RNA和脂多糖等。
4.包涵体形成的本质 ——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面： ①折叠状态的蛋白质的聚集作用； ②非折叠状态的蛋白质的聚集作用； ③蛋白质折叠中间体的作用。
容易得到和天然蛋白相似的产物
③ 融合标签的免疫原性越少越好
融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫
2.1 His蛋白标签
特点
优势
6×组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象 影响的
使用的是温和的洗脱液环境
6×组氨酸标签比普通的标签（Tag）要 小得多
在天然或变形的条件下进行一步纯化
结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构 产生影响
洗涤： 通常用低浓度的变性剂如2M尿素洗涤，用温和去垢剂TritonX-100洗涤去 除膜碎片和膜蛋白。
溶解： 常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍，通过离子间的相互作用，破坏包 涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。
7. 包涵体复性方法
① 稀释复性 ② 透析复性 ③ 超滤复性 ④ 柱上复性
（二）可溶性蛋白-融合蛋白
① 防止因转录提前终止 ② 存在正常的转录终止序列
3、外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则： ① ATG起始密码子。 ② SD序列 ③ 在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。
④ 密码子的选择性 主密码子 （major codon） 罕用密码子（rare codon）
3.包涵体的组成 蛋白质
外源基因的表达产物：占大部分，具有正
确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵 体蛋白一般没有生物学活性。
受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、
核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋 白等。
非蛋白质 ：包括DNA、RNA和脂多糖等。
4.包涵体形成的本质 ——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面： ①折叠状态的蛋白质的聚集作用； ②非折叠状态的蛋白质的聚集作用； ③蛋白质折叠中间体的作用。
容易得到和天然蛋白相似的产物
③ 融合标签的免疫原性越少越好
融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫
2.1 His蛋白标签
特点
优势
6×组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象 影响的
使用的是温和的洗脱液环境
6×组氨酸标签比普通的标签（Tag）要 小得多
在天然或变形的条件下进行一步纯化
结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构 产生影响
洗涤： 通常用低浓度的变性剂如2M尿素洗涤，用温和去垢剂TritonX-100洗涤去 除膜碎片和膜蛋白。
溶解： 常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍，通过离子间的相互作用，破坏包 涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。
7. 包涵体复性方法
① 稀释复性 ② 透析复性 ③ 超滤复性 ④ 柱上复性
（二）可溶性蛋白-融合蛋白
① 防止因转录提前终止 ② 存在正常的转录终止序列
3、外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则： ① ATG起始密码子。 ② SD序列 ③ 在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。
④ 密码子的选择性 主密码子 （major codon） 罕用密码子（rare codon）
外源目的基因表达与调控(1)
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13
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14
Western blot基本原理
A. Direct Detection
B. Indirect Detection
Figure 1A. In the direct detection method, labeled primary antibody binds to
antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a detectable signal.
特异性mRNA的检测: Northern杂交 特异性蛋白质的检测: ELISA, Western杂交
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1
1.Northern 印迹杂交(Northern blot)
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的区别
– 靶核酸：RNA – RNA电泳: 在变性条件下进行,以去除RNA中的
的量直接相关
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4
ELISA原理图
②酶标记的抗原或抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
可编辑版
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
5
ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。
直接法：
直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原 结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸 光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a
间接法：
是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结 合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产 物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗 原或抗体的量。见图b
夹心法：
掌握基因工程技术的实验技巧与方法优化策略
掌握基因工程技术的实验技巧与方法优化策略基因工程技术是一门重要的生物技术，通过改变生物体的基因组来实现对生物体特征的调控和改良。
在基因工程技术的实验过程中，掌握实验技巧和方法优化策略是非常关键的。
本文将介绍一些常见的实验技巧和方法优化策略，帮助读者更好地掌握基因工程技术。
首先，合理选择适合的表达载体是基因工程实验的基础。
表达载体是将目标基因导入宿主细胞并进行表达的载体，常用的有质粒和病毒等。
质粒通常用于原核细胞表达，病毒则常用于真核细胞表达。
在选择表达载体时，需要考虑宿主细胞的类型、目标基因的长度和复杂度等因素，以确保目标基因能够有效地表达。
其次，正确设计和合成引物是基因工程实验的关键步骤。
引物是用于PCR扩增目标基因的短寡核苷酸序列，必须具有良好的选择性和特异性。
设计引物时，要避免引物间的互补性或自身的二级结构，以免影响PCR扩增效果。
此外，合成引物时要选择可靠的合成技术和供应商，确保引物的质量和纯度。
实验中，PCR扩增是基因工程技术中最常用的方法之一。
为了获得高质量的PCR产物，需要注意以下几点。
首先，优化反应条件，包括引物的浓度和选择性、反应体系中的酶和缓冲液的浓度、PCR循环的温度和时间等。
其次，确保反应体系中的杂质和阻碍物的最小化，以免影响PCR反应的准确性和效率。
另外，在PCR反应中使用专门的试剂盒和优质的试剂，可以有效提高PCR反应的效果。
分子克隆是基因工程技术中另一个常用的实验方法，用于将目标基因插入到表达载体中。
在分子克隆中，需要选择适当的酶切位点和粘性末端，以确保目标基因的正确插入。
此外，还需要进行DNA连接反应和转化实验，以将目标基因插入到表达载体中的合适位点。
在进行分子克隆实验时，要注意使用高效的酶切和连接酶，并确保酶切和连接反应的条件的最优化。
最后，实验前后的分析与验证也是非常重要的。
在验证目标基因的表达是否成功时，可以借助Western blot、RT-qPCR等技术。
第七章-外源基因的表达PPT课件
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够 构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效 率、高水平地表达。对于原核细. 胞来讲，基因表达的调控序 4
■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RN
5
原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启 动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右 向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。
（2）终止子
在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序 列 ， 它 有 终 止 转 录 的 功 能 ， 这 一 段 DNA 序 列 称 为 终 止 子 （terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一 段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文 对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。
这个载体系统是由pBR322为基础构建的。 ➢带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启 动子。在启动子的下游装有lac UV5的启动子及其操纵基因， 并把lac阻遏子的基因（lac I）也克隆到这个质粒上。这样目 的基因的表达就成为可调节的了。 ➢在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（SD序列及ATG）。 ➢信号肽序列取自于大肠杆菌中. 分泌蛋白的基因ompa（外膜9 蛋白基因）。
根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子 的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。
外源基因的表达及其优化策略
5’ TTGACA
17bp
TATAAT
转录起始位点
核糖体结合位点
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子
（2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS）
Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体 16sRNA结合的序列。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 lacI
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
产物提纯: GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱 分离纯化。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列
段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列
3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 ：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子 ：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到
生理学水平的异位染色质位点
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）
三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，
rRNA和mRNA。
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。
rrnB T
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：
基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1)
◆ 融合型表达
蛋白质回收 ：
融合蛋白的位点 专一性断裂方法
化学断裂法 酶促裂解法
单残基位点
多残基位点
载体 蛋白
切割 位点
多克隆 酶切位点
目的 蛋白
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因的表达形式
◆ 寡聚型表达
定义：将多拷贝的外源基因克隆在一个低 拷贝质粒上，以获得目的蛋白的高效表达。
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（二） 外源基因在酵母菌中的表达
酵母菌的宿主系统
提高表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
（二） 外源基因在酵母菌中的表达
已用于外源基因表达和研究的酵母菌
酿酒酵母（Sacchaoomyces cerevisiae） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveroyces lactis） 非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoyces pombe） 多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
高等哺乳动物细胞的生长特性
锚地依赖性 血清依赖性 接触抑制性 形态依赖性
（三） 外源基因在哺乳动物细胞内 的表达
作为受体细胞的条件
细胞系便于大规模培养 遗传稳定性 合适的标记 生长快且齐 安全性能好
外源基因的表达
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。
❖增强子的特性： ➢双向性。 ➢重复序列。 ➢增强子行使功能与所处的位置无关。 ➢特异性。 ➢增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
•Ⅲ型启动子
内启动子：位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA 的启动子。
外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部 序列，如脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启 动子，结构类似于真核生物Ⅱ型启动子。
6.2.1.3 启动子与转录启动
大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分
亚基 基因 氨基酸含量 数量 分子量（kD）
➢绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通 过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。
6.2.6 反义子
反义RNA（antisence RNA）：同某种天然mRNA反向互补的 RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产 生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA 的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应 用，此项技术特称为反义技术学（antisence techology）。
在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对 tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也 就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时， 核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构 是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵 子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻 的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对， 3-4区可自由配对形成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对 RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。
❖增强子的特性： ➢双向性。 ➢重复序列。 ➢增强子行使功能与所处的位置无关。 ➢特异性。 ➢增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
•Ⅲ型启动子
内启动子：位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA 的启动子。
外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部 序列，如脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启 动子，结构类似于真核生物Ⅱ型启动子。
6.2.1.3 启动子与转录启动
大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分
亚基 基因 氨基酸含量 数量 分子量（kD）
➢绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通 过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。
6.2.6 反义子
反义RNA（antisence RNA）：同某种天然mRNA反向互补的 RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产 生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA 的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应 用，此项技术特称为反义技术学（antisence techology）。
在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对 tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也 就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时， 核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构 是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵 子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻 的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对， 3-4区可自由配对形成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对 RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。
基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动
基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。
一．真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件：⑴载体能够独立复制，具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。
⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。
二．影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素：5’-UTR对克隆基因表达效率的影响a. 启动子结构对表达效率的影响大肠杆菌启动子的保守序－35区（5’TTGACA）和－10(5’TATAAT)区；它们之间的距离(17bp)。
b. 启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响当mRNA分子5’-末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下降。
2.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响a. 转译起始序列对表达效率的影响SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时，下降50%或25%；位于起始密码子AUG上游的密码三联体的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG时下降20倍；位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。
b. mRNA的稳定性对表达效率的影响3.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的）高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。
第六章外源目的基因表达与调控
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
本底水平转录
lacI RNA 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
高效转录
lacI RNA 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
葡萄糖代谢 cAMP浓度降低
高效转录
RNA RNA 聚合酶 聚合酶 Plac lacO lacZ lacY lacA
cAMP
cAMP CAP CAP RNA 聚合酶 Plac
本底水平转录
lacI
lacO
lacZ
lacY
lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
4.密码子
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白 质编码基因，对简并密码子使用频率并不 相同，具有一定的偏爱性。外源基因在大 肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。
5.选择标记
大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗 性基因。
(二)宿主菌
外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降 解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应 的大肠杆菌宿主菌。如BL21。
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。 启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
基因工程-第六章 外源目的基因表达与调控
三、终止子（Terminator）： 在基因转录后，RNA聚合酶遇到时能使转 录终止的DNA序列。 四、衰减子（Attenuator）： 原核生物基因表达调控的精细调节装置 ，利用转录与翻译相偶联的特性，依赖自身 巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对 基因转录进行开关式的微调作用。
五、绝缘子（Insulator）： 一种具有顺式调控作用的边界元件，能 使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外正调控和负调控信号的影响。 六、反义子（Antisensor）： 反义RNA（Antisense RNA）是一类与特 定DNA序列互补的小分子RNA，编码反义RNA 的DNA称为反义子。
第二节基因表达的调控元件（ Elements of Gene Expression）
一、启动子（Pro 列，位于表达基因的上游，不超过200bp。 ①序列特异性； ②方向性； ③位置特性； ④种属特异性
二、增强子（Enhancer）： 能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用 序列。 ①双向性； ②具有重复序列； ③增强子行使功能与所处的位置无关； ④特异性 ⑤增强子不仅与同源基因相连时有调控 功能，与异源基因相连时也有功能。
Chapter 6 Expression and Regulation of Exogenous Gene
第一节外源基因表达机制（ Mechanisms of Exogenous Gene）
Transcription Translation
DNA
RNA
protein
一、外源基因的起始转录： 有效表达是基因工程的核心问题。 诱导型 启动子 组成型 二、mRNA的延伸与稳定： 外源基因有效表达的关键。 弱化子（衰减子，Attenuator），Poly （A）加尾信号：AAUAAA位点。
外源基因的表达体系
包涵体
其他表达系统及对比
酵母表达系统： 酵母表达系统： 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 宿主菌：毕赤酵母、酿酒酵母 宿主菌：毕赤酵母、
三种表达系统的对比
特有优点 芽胞杆菌表达系统 无毒（ 1. 无毒（除炭疽芽胞杆 蜡样芽胞杆菌） 菌、蜡样芽胞杆菌） 2. 分泌胞外蛋白 遗传学背景最全 1．无毒 2．真核修饰 缺点 1.分泌蛋白酶 1.分泌蛋白酶 2.质粒稳定性差 2.质粒稳定性差 3.无真核修饰 3.无真核修饰 1．易形成包涵体 易形成包涵体 2．无真核修饰 产乙醇
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统
共同点：发酵周期短、 共同点：发酵周期短、遗传学研究全面
Thank you for your attention!
芽胞杆菌表达系统
蛋白折叠： 蛋白折叠： 枯草芽孢杆菌 内陪伴分子（intracellular molecular chaperones） ） 外陪伴分子（extracytoplasmic molecular chaperones） ） PrsA 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 WB600[pEPP]型含有 型含有PrsA WB600[pEPP]型含有PrsA WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 型有内外陪伴 WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶——保护巯基 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶 保护巯基
芽胞杆菌表达系统
蛋白酶缺陷型菌株： 蛋白酶缺陷型菌株： WB600存在vpr（丝蛋白酶） WB600存在vpr 丝蛋白酶） 存在vpr（ WB700全部缺陷 WB700全部缺陷 WB800去除内源蛋白酶的影响 WB800去除内源蛋白酶的影响
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真核与原核生物结构上存在差别
一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动
子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。
Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰 基转移酶。
一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要
酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它 们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。
用原核生物作宿主。 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的
传递过程。
中心法则 central dogma
克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞
一、影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系
5’ TTGACA
17bp
TATAAT
转录起始位点
核糖体结合位点
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子
（2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS）
Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体 16sRNA结合的序列。
rrnB T
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：
条件： 必须选择一个有
lacI的宿主菌。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。
如：pIN III系列：
pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
蛋白质的合成是在细胞之中进行的
目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总
蛋白的20%～40%。
目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于
（三）翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响
（四）表达系统对表达产物的影响
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞 两部分组成。
宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：
大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：
本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分 泌到周质空间，或外泌到培养液中。
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 1）强启动子: tac（trp-lac）
trp的-35区
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统。
lac操纵基因
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。
二、外源基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统 合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化 学合成基因，而不能用基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基 因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架 (ORF)。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 pIN III系列 组成结构 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。
Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因 的表达产物对宿主菌的毒害。
原核生物基因表达载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统
大肠杆菌表达载体的基本成分
五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式
表达产物
位于 形式
细胞质 细胞周质 细胞外
包涵体蛋白 融合蛋白 整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白
细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会
发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。
包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚 集折叠而成的晶体结构物。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体
pIN III-comA1
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一 起的。 如：pGEX系列
优点：便于融合蛋白的分离和纯化。
组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）
三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，
rRNA和mRNA。
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。
产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统
pGEX系列插入区
pGEX-1X的插入区
pGEX-2X的插入区 pGEX-3X的插入区
四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）
在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑 溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
的特殊序列。
T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段
四、常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。
S-D序列
ATG-外源基因-TAG
优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。
段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列
3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 ：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子 ：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到
生理学水平的异位染色质位点
TATA box GC box CAAT Box 提高转录准确性与频率
2)增强子：远离转录起始点（上游或下游）、决定组织特异件，对基因转录起阻遏作用
（二）顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 ：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 2)衰减子：操纵子的前导区(操纵子内开始转录到结构基因编码开始位置之间的一
（一）阅读框架(open reading frame)对外源基因表达的影响 （二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响
顺式作用元件是转录调节因子结合位点，如启动子、增强子和沉默子
1.对基因转录起始的调控 2.对基因转录终止的调控 3.对DNA结构的影响
（二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子 ：RNA聚合酶及转录起始点周围的一组转录控制组件
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密 码防止核糖体跳跃（skipping）。
5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率
码子和反密码子系统，转变为由特定氨基酸顺序构成的 多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所 有加工过程。
基因工程中，基因高效表达研究是指外源基因在某种细 胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个 基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达 产物。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 lacI
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
产物提纯: GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱 分离纯化。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列
一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动
子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。
Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰 基转移酶。
一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要
酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它 们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。
用原核生物作宿主。 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的
传递过程。
中心法则 central dogma
克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞
一、影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系
5’ TTGACA
17bp
TATAAT
转录起始位点
核糖体结合位点
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子
（2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS）
Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体 16sRNA结合的序列。
rrnB T
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：
条件： 必须选择一个有
lacI的宿主菌。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。
如：pIN III系列：
pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
蛋白质的合成是在细胞之中进行的
目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总
蛋白的20%～40%。
目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于
（三）翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响
（四）表达系统对表达产物的影响
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞 两部分组成。
宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：
大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：
本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分 泌到周质空间，或外泌到培养液中。
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 1）强启动子: tac（trp-lac）
trp的-35区
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统。
lac操纵基因
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。
二、外源基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统 合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化 学合成基因，而不能用基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基 因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架 (ORF)。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 pIN III系列 组成结构 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。
Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因 的表达产物对宿主菌的毒害。
原核生物基因表达载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统
大肠杆菌表达载体的基本成分
五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式
表达产物
位于 形式
细胞质 细胞周质 细胞外
包涵体蛋白 融合蛋白 整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白
细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会
发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。
包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚 集折叠而成的晶体结构物。
四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体
pIN III-comA1
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一 起的。 如：pGEX系列
优点：便于融合蛋白的分离和纯化。
组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）
三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，
rRNA和mRNA。
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。
产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统
pGEX系列插入区
pGEX-1X的插入区
pGEX-2X的插入区 pGEX-3X的插入区
四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）
在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑 溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
的特殊序列。
T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段
四、常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。
S-D序列
ATG-外源基因-TAG
优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。
段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列
3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 ：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子 ：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到
生理学水平的异位染色质位点
TATA box GC box CAAT Box 提高转录准确性与频率
2)增强子：远离转录起始点（上游或下游）、决定组织特异件，对基因转录起阻遏作用
（二）顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 ：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 2)衰减子：操纵子的前导区(操纵子内开始转录到结构基因编码开始位置之间的一
（一）阅读框架(open reading frame)对外源基因表达的影响 （二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响
顺式作用元件是转录调节因子结合位点，如启动子、增强子和沉默子
1.对基因转录起始的调控 2.对基因转录终止的调控 3.对DNA结构的影响
（二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子 ：RNA聚合酶及转录起始点周围的一组转录控制组件
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密 码防止核糖体跳跃（skipping）。
5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率
码子和反密码子系统，转变为由特定氨基酸顺序构成的 多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所 有加工过程。
基因工程中，基因高效表达研究是指外源基因在某种细 胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个 基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达 产物。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 lacI
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
产物提纯: GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱 分离纯化。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列