天然无抗菌活性链霉菌种间原生质体融合与活性重组体的分离
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
链霉菌的分子育种策略
链霉菌的分子育种策略摘要：现在链霉菌的选育已经进入分子育种阶段。
其过程包括利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；利用基因筛选程序，筛选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物；利用基因组重排技术对出发菌株进行处理等。
链霉菌接合转移体系研究的提出为分子育种打开了一个新的方向。
系统改变基因结构可产生一个完整的突变株文库，从而构建大规模生产不同抗生素的工程菌。
关键词：链霉菌，分子育种，基因Method of Streptomyces’s molecular breeding Abstract:Now The breeding of Streptomyces has entered the stage of molecular breeding. The process includes: Using genedisruption, knockout, replacement mutation technology tounderstand gene function, expression, regulation and control and then have the, modification of antibiotics. The secondarymetabolite biosynthesis gene cluster is transferred to the easy industrial operation of the host system, introducing theresistance gene, gene regulation and introducing the hemoglobin gene;Use of genetic screening programs, screening of specific types of compounds containing the gene producing strain, and obtained the corresponding secondary metabolites;Use of genome shuffling on the starting strain processing and so on . the conjugative transfer system research of Streptomyces has openeda new direction for molecular breeding System changes in genestructure can produce a complete mutant library, so as toconstruct the mass production of different antibioticengineering bacteria.Key words: Streptomyces；molecular breeding,；DNA链霉菌是一类细胞壁类型为I型、革兰氏阳性、好气的最高等的放线菌。
原生质体融合技术简介
(1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
在链霉菌原生质体融合育种方面
邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌 的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产 生原养型重组体的频率为10-4。其中有58% 产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌 株(300ug/ml)提高5—6倍的融合子。
杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定 霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株 进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种 间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较 亲株提高了2.6倍的融合子。
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
原生质体融合技术简介
一 原生质体融合
定义：原生质体融合就是将两个亲株的细 胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在 高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的 球状原生质体。然后将两个亲株的原生质 体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融， 使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发 生两次基因组之间的接触、交换、遗传重 组，在再生细胞中获得重组体。
2022年江苏大学京江学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年江苏大学京江学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、不同的放线菌有不同的典型形态，如______属的基内菌丝会断裂成大量的杆菌状体，______属等可在菌丝顶端形成少量孢子，______属具有孢囊并可产生孢囊孢子，而______属则具有孢囊，但产生的是游动孢子等。
2、植物病毒一般可引起宿主植物三类明显的症状：① ______；② ______；③ ______。
3、根据受氢体性质不同，可把生物氧化分为______、______和______ 三种类型。
4、碳源对微生物的功能是______和______，微生物可用的碳源物质主要有______、______、______、______、______和______等。
5、酵母菌的无性繁殖方式主要有______和______。
6、原生动物是______色、无______，能______运动的单细胞真核生物。
7、最常见的厌氧菌有① ______，② ______，③ ______，④ ______，⑤ ______，⑥ ______等。
8、一般来说，在土壤中，各种微生物含量按递减顺序排列如下：______、______、______、______、______和______。
9、Avery和他的合作者分别用降解DNA、RNA和蛋白质的酶作用于有毒的S型细胞抽提物，然后分别与______混合，结果发现，只有DNA被酶解而遭到破坏的抽提物无转化活性，说明DNA是转化所必须的转化因子。
10、外毒素的种类很多，常见的如______、______、______和______ 等。
二、判断题11、因支原体的细胞大小接近病毒，故具有滤过性。
（）12、用分装器将培养基分装试管时，应谨防培养基沾染试管口。
（）13、原核生物呼吸链的P/O比一般较真核生物高。
（）14、在昆虫颗粒体病毒的每一个蛋白质包含体中，都包裹着数量很多的杆状病毒体。
湖北省武汉市部分学校联合体2022-2023学年高二下学期期末联考生物试题及答案
2022～2023学年度第二学期联合体期末联考高二生物试题考试时间：2023年6月26日下午14：30-17:10试卷满分：100分注意事项:1．答题前，先将自己的姓名、准考证号、考场号、座位号填写在试卷和答题卡上，并将准考证号条形码粘贴在答题卡上的指定位置。
2．选择题的作答：每小题选出答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
3．非选择题的作答：用黑色签字笔直接答在答题卡上对应的答题区域内。
写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
一、选择题：本题共20小题，每小题2分，共40分。
每小题只有一项符合题目要求。
1.科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内,使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。
此过程不涉及的操作是A.超数排卵B.精子获能处理C.胚胎培养D.细胞核移植2.“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色3.人参皂苷是人参的主要活性成分。
科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。
下列叙述错误的是A.细胞融合前应去除细胞壁B.高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合C.融合的细胞即为杂交细胞D.杂交细胞可能具有生长快速的优势4.单克隆抗体与脂质体(双层磷脂分子构成的封闭球状结构)的脂膜相连构建的免疫脂质体，可作为载体将紫杉醇运输到肿瘤细胞。
紫杉醇是红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，具有高抗癌活性。
下列叙述错误的是A.免疫脂质体将药物送入靶细胞体现了生物膜的结构特点B.单克隆抗体是由淋巴细胞产生C.免疫脂质体利用抗原—抗体之间的特异性识别发挥靶向作用D.可利用植物细胞培养技术使细胞增殖以获得更多的紫杉醇5.天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。
第七章放线菌遗传
第一节 链霉菌的染色体
一、链霉菌的染色体DNA
光学显微镜和电镜观察表明，像其他细菌的染色体一样， 天蓝色链霉菌A3(2)的染色体 DNA在细胞中以致密的、拟核 状态存在。
链霉菌的染色体DNA也是形成许多超螺旋区域，并与蛋白 质和RNA分子结合在一起。染色体在菌丝中以多拷贝形式存 在，而在孢子中以单拷贝形式存在。
1.链霉菌中的质粒类型
大多数链霉菌都含有质粒，几乎都是自主转移质粒，它们 在链霉菌的接合过程中起着重要作用。少数质粒与抗生素的 产生、形态分化等有关。链霉菌中的质粒，大小从4kb到 600kb，拷贝数从几个到几百个，有线性和环状两种类型。
(1)线性质粒 链霉菌中有很多质粒在形态上是线性的，如 SCPl、pSLA2等。链霉菌中的线性质粒与链毒菌的线性染色 体一样，在DNA两端具有TIR和5′末端蛋白。
为什么链霉菌中与接合作用有关的质粒一般都较小？ 这可能与链霉菌的接合方式有关，链霉菌细胞之间的
接合不需要性菌毛，而大肠杆菌的接合作用则依赖于质粒 编码的性菌毛的作用。大多数链霉菌的质粒的接合效率能 达到100％。
(1)天蓝色链霉菌SCP1质粒
1971年，通过遗传研究证明，SCP1质粒控制着寄主天蓝色链 霉菌的致育性，但由于它是一种巨大质粒，难于分离和进行深 入研究。直到20世纪80年代末和90年代初，才对它的分子结 构有了深入了解。
2.灰色链霉菌染色体缺失使afsA位点丢失
灰色链霉菌2247的染色体是7.8Mb的线性染色体。A因子(A factor)是一种细菌激素，对链霉素(Strepotmycin)的产生和 孢子形成起着正调节作用，afsA基因产物是A因子生物合成的 一个关键酶。afsA基因距离染色体左末端150kb。afsA基因 在高温条件下培养或用UV照射后，以高频率丢失。
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
原生质体融合技术简介
作者 Xu
Jin
Khattab
酵母
对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合
处理低浓度含铬废水时， 卢显妍 去除率和还原率可达100%， 处理高浓度含铬废水 (200mg/L) 时 ， 还 原 率 达 50%
黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 与 阿 特 拉 津 降 解 菌 青 霉(Penicillium sp)
(T.atroviride)
进行融合
豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium
leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤
菌
(Sinorhizobium
动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
吸水链霉菌代谢产物应用研究进展
吸水链霉菌是一类抗菌谱广、 遗传性状稳定 的拮抗 菌， 产生的抗菌活性物质对多种植物病原 菌具有强烈的
拮 抗作 用 。
１ １ 抗真 菌活 性研 究概 况 ．
提高 ４ ．％ ， １３ 经传代试验证 明其 具有较好 的遗 传稳定
性 。张茜茜 等 对 吸水 链 霉 菌 井 冈变 种 Ｋ Ｎ一１ 行 ６进
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｐｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ａ ｏ ｉｅ ｒ ｍ ｔｅ ｏ ｃ ｓ ｈ ｇ ｏ ｃ ｐｉｕ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ Ａｐ ｉ ｔｏ ｆＭ ｔ ｂ ｌｔ ｓ ｆｏ Ｓ ｒ ｐｔ ｍｙ ｅ ｙ ｒ ｓ ｏ ｃ ｓ ｃ
Ｃ Ｉ ａ ，Ｈ ｏ ｇ ， Ｉ ｉｇ ， Ｅ ｉ ｇ— ｕ ， Ｈ ｏ ｇ— ｉ ｌ“ Ｕ Ｙ ＥＬ ｎ ＬＵＴｎ Ｌ Ｉ ａ Ｘ ｎ ｈ ａ Ｚ Ｕ Ｈ ｎ ｊＪ ａ
Ｔ０７菌株 产生 的一 种 新 抗 生素 Ｔ０ ７ ００ ００ Ａ专 一 性 地对 梭
件， 在该条件下 ， 阿扎霉素 Ｂ的产量达到 １３ ｇＬ 提 ４４ｍ ／ ，
4-1.链霉菌的分子生物学
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
生物药物的分类基因重组多肽蛋白类治疗剂基因药物
1、生物药物的分类：（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。
DNA重组药物和基因药物的区别：DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
3、DNA重组药物主要有哪几类，举例说明。
DNA重组药物有：（1）细胞因子干扰素类：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-α和TNF-α受体。
（3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α和TGF- β）、神经生长因子（NGF）及各种神经营养因子。
（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等（7）重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。
2 简述生物活性物质分离纯化的主要原理：根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。
链霉菌原生质体的制备
链霉菌原生质体的制备透压极为敏感的球质体, 最外层是裸露的细胞物及细胞器缺损少, 修复能力高, 再生效果好。
质膜, 失去了细胞壁的原生质体, 染色体但由于菌种不同仍然存在差异。
如吸水链霉菌DN A在诱变剂作用下, 更易引起死亡突变, 敏感性提菌株及庆丰链霉菌的菌井冈变种的4 201 V A S高。
菌种的敏感性越高, 诱发突变的机会越大。
株, 以对数中期为好, 再生率为静止期的 40, 因此, 用原生质体代替孢子、菌丝细胞作为诱变 50 倍。
而菌株则以对数后期为好, 再生率 2 V A育种的材料, 能显著提高诱发突变的频率, 由于是静止期的 24 倍。
( ) 2菌丝的预处理链霉菌的破壁一般都去除了细胞壁, 原生质体膜易于融合, 即使没有接合、转化和转导等遗传系统也能发生基因组采用溶菌酶。
有些链霉菌种对溶菌酶敏感 , 如的融合重组。
庆丰链霉菌, 菌丝培养时不需经过预处理, 即可直接制备出原生质体。
但很多菌种对溶菌酶不用原生质体融合及诱变进行育种, 具有用孢子、菌丝的细胞融合、诱变育种不可替代的优敏感, 菌丝必须经过预处理。
方法有:越性。
? 在培养基中加入 0. 5%, 4% 的甘氨酸。
原生质体制备和再生的一般程序: 菌丝培具体浓度随菌种而异。
甘氨酸可以代替2丙氨 D养?菌丝悬液?离心得到菌丝沉淀?用蔗糖液酸掺入细胞壁, 破坏细胞壁肽聚糖短肽间的交洗涤两次?加酶液酶解一定时间得到原生质体联, 引起细胞壁结构的不完整以便于酶解脱壁。
悬液?原生质体的分离和离心收集?用高 ? 甘氨酸在增加菌丝对酶的敏感性的同时, 也P渗液重新悬浮原生质体?原生质体再生抑制菌丝的生长, 使菌丝量锐减。
因此为了减少1 原生质体的制备甘氨酸对菌丝生长的抑制作用, 培养基内加甘(1. 1 菌丝氨酸的量可酌情减少, 并同时增加过量蔗糖可( ) ) 能干扰细胞的正常代谢, 也得到相同效果。
? 1菌丝的培养时间处于不同生长时期分两次培养菌丝, 使得菌丝在新鲜培养基中能的菌体, 经过处理后都可以形成原生质体, 但其活性差异很大。
链霉菌挥发性化合物提高植物抗病能力的研究进展
不合理使用化学农药会破坏生态环境，威胁人类健康。
植物根际促生菌（plant growth promoting rhi-zobacteria ，PGPR ）为一种生防剂，具有安全、环保、高效的特点，逐渐成为农业绿色高质量发展关注的热点。
链霉菌是PGPR 的一类，广泛分布于土壤、水体等生态系统中，大多具有抗菌活性和能产生天然次级代谢产物的能力。
链霉菌不但可以通过溶磷、固氮、产铁和调节植物激素等方式[1，2]促进植物生长，而且其产生的挥发性化合物（volatile organic compounds ，VOCs ）也具有较高的抗菌活性，对细菌和真菌引起的各种植物病害具有防治作用。
对链霉菌VOCs 的分类、VOCs 常用分离鉴定技术、VOCs 对常见植物病原菌的抑制作用以及作用机制研究进展等进行总结，旨为链霉菌VOCs 的深入研究和产品定向开发提供参考。
1微生物的VOCsVOCs 是一类小分子、易挥发的化合物，主要包括烯烃、烷烃、醇、酮、萜类、苯类、醛、吡嗪、酸、酯和含硫化合物[3]。
VOCs 检测在生物学、环境科学、医学、食品工业等领域应用广泛。
微生物产生的VOCs 具有调节植物生长、刺激植物产生激素、诱导植物系统免疫抗性等功能。
VOCs 通过与细胞之间的相互作用[4]，参与调节植物生长发育、抑制病原菌侵染的过程。
合理利用微生物产生的VOCs ，在未来具有很大的应用潜力。
不同细菌的代谢途径不完全一摘要：研究微生物代谢相关新技术的迅猛发展，使研究者们从微生物次生代谢产物中发现了更多新的挥发性物质，这些挥发性物质在植物生长发育过程中起到多种重要作用。
在众多微生物中，链霉菌产生的次生代谢产物种类最多、功能最复杂。
以链霉菌为例，综述了其产生的挥发性化合物（VOCs ）的类型、VOCs 常用分离鉴定方法、VOCs 对几种常见植物病原菌的抑制作用以及作用机制，旨为链霉菌VOCs 的深入研究和产品开发提供参考。
关键词：链霉菌；挥发性化合物；植物病害；ISR 中图分类号：Q939文献标识码：A 文章编号：1008-1631（2022）03-0053-06收稿日期：2022-03-04基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1901004-4）；河北省农林科学院创新工程专项（2022KJCXZX-ZHS-3）；河北省重点研发计划项目（19222902D ）作者简介：郭纹余（1996-），女，壮族，广西桂林人，硕士研究生在读，研究方向为资源利用与植物保护。
植物内生真菌分离培养的研究方法
王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K
链霉菌的分子生物学课件
05
链霉菌代谢组学
代谢组测序技术
质谱技术
01
利用质谱仪对链霉菌代谢物进行分离和鉴定，具有高灵敏度、
高分辨率和高通量的优点。
核磁共振技术
02
通过核磁共振波谱对链霉菌代谢物进行分析，具有无损、无标
记和可重复性的优点。
色谱技术
03
利用色谱柱对链霉菌代谢物进行分离，结合检测器对代谢物进
行定性和定量分析。
生物转化
利用链霉菌的生物转化能力， 可将某些化合物转化为具有更
高附加值的产物。
02
链霉菌基因组学
基因组测序技术
01
Sanger测序法
利用DNA聚合酶和特异性引物进行DNA片段的测序，是第一代测序技
术。
02
第二代测序技术
基于边合成边测序的原理，具有高通量、低成本等优点，如Illumina公
司的HiSeq和MiSeq测序平台。
酶制剂的基因工程改造
通过基因工程技术，人们可以对链霉菌产生的酶进行基因改造，提高其催化效率、稳定性或改变 其底物特异性，从而满足工业生产的特定需求。
新型酶制剂的发掘
随着基因组学和代谢组学等技术的发展，人们可以从链霉菌中发掘更多具有潜在工业应用价值的 新型酶制剂。
生物农药的研发与生产
生物农药的优势
杀虫蛋白的研究与应用
06
链霉菌分子生物学研究方法
基因克隆与表达技术
基因克隆技术
通过PCR扩增目的基因，将其插入到克隆载体中，转化宿主细胞进行扩增，从 而获得大量目的基因克隆。
基因表达技术
将目的基因与表达载体连接，导入宿主细胞中进行表达，通过诱导或选择压力 使目的蛋白大量表达，进而研究其功能。
基因敲除与突变技术
链霉菌与抗生素的发现与应用
新型抗生素的研发周期长、投入大，且成功率不高，使得抗生素的 研发面临较大挑战。
发展前景
新型抗生素研发
针对耐药性细菌，研发具有全新作用 机制的新型抗生素，提高治疗效果。
合成生物学技术应用
利用合成生物学技术，设计和构建新 的生物部件、设备和系统，以生产具 有优良性能的抗生素。
联合治疗
将不同作用机制的抗生素联合使用， 以提高疗效并降低耐药性产生的风险 。
临床应用
抗生素广泛应用于治疗各种细菌感染，如肺炎、尿路感染、皮肤感染等。同时， 在手术前预防感染、治疗动物感染等领域也有广泛应用。
抗生素发展历程及现状
发展历程
自20世纪40年代青霉素被发现以来，抗生素经历了快速发展和广泛应用的过程。随着科技的不断进步，新型抗生 素不断问世，为临床治疗提供了更多选择。
抗生素定义
抗生素是一类能够抑制或杀死细菌生长的药物，广泛应用于治疗细菌感染。
抗生素分类
根据化学结构和作用机制，抗生素可分为β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类 、大环内酯类、喹诺酮类等多种类型。
抗生素作用机制及临床应用
作用机制
抗生素通过干扰细菌细胞壁合成、抑制蛋白质合成、破坏细胞膜完整性等机制， 达到抑制或杀死细菌的目的。
或最终产物。
共生与竞争
03
链霉菌在与其他微生物共生或竞争过程中，产生了抗生素作为
防御或攻击手段。
链霉菌在抗生素研发中地位
天然来源
链霉菌是自然界中广泛存在的微生物，是抗生素的天然来源之一 。
药物研发
通过对链霉菌的研究，人们发现了许多具有抗菌活性的化合物， 为抗生素的研发提供了重要线索。
工业生产
链霉菌易于培养且产量高，因此被广泛应用于抗生素的工业生产 中。
抗生素复习资料
抗⽣素复习资料现代定义：⽣物所产⽣的能够在低微浓度下有选择地影响它种⽣物机能的有机物。
抗⽣素时代的开创1929年，Fleming发现青霉素1940年，Chain和Florey提取纯化了青霉素，1943年，实现了青霉素的⼯业⽣产1943年，Waksman发现链霉素1957，Umezawa发现卡那霉素临床上应⽤的抗⽣素有时存在以下问题：耐药菌过敏反应毒性较⼤活性较低等酶抑制剂概念的提出：梅泽滨夫(Umezawa)微⽣物有机体内酶及其抑制剂是共存的梅泽滨夫研究⼩组的⼯作开创了微⽣物药物的新纪元微⽣物药物基于微⽣物整体或实体的药物：菌苗、疫苗。
来源于微⽣物初级代谢产物的药物：氨基酸、维⽣素。
来源于微⽣物次级代谢产物的药物：抗⽣素、其它⽣理活性物质（酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂等）。
微⽣物药狭义内涵：来源于次级代谢产物抗⽣素剂量表⽰法效价单位：每ml或每mg样品中所含某种抗⽣素有效成分的多少效价是衡量抗⽣素有效成分的尺度，也是衡量抗⽣素性能的标志青霉素效价表⽰⽅法：（稀释单位法）1个青霉素效价单位=抑制50ml⾁汤培养基中⽣长的⾦黄⾊葡萄球菌的最⼩青霉素浓度1mg青霉素G钠盐能抑制83350ml⾁汤中⽣长的葡萄球菌，所以1mg青霉素G钠盐的效价单位为1667u。
链霉素SM效价（重量单位法）：规定链霉素效价单位=1000u/mg（C21H39O12N7，SM分⼦量581.6）链霉素硫酸盐（C21H39O12N73/2H2SO4，盐分⼦量728.7）链霉素硫酸盐效价=SM理论效价×SM分⼦量/盐分⼦量=1000×581.6/728.7=798u/mg抗菌谱：把某种抗⽣素所能抑制或杀灭病原体的范围和剂量称为该种抗⽣素的抗菌谱。
抗⽣素分类：⼀、按产⽣菌分类真菌产⽣的抗⽣素：如青霉素、头孢菌素、灰黄霉素放线菌产⽣的抗⽣素：如链霉素（灰⾊链霉菌）、红霉素（红⾊链霉菌）、四环素（⾦⾊链霉菌）、林可霉素（林肯链霉菌）庆⼤霉素（⼩单孢菌）等细菌产⽣的抗⽣素：如多粘菌素、杆菌肽、短杆菌肽植物及动物产⽣的抗⽣素：地⾐酸、绿藻素、蒜素。