9基因操作

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三、DNA重组与分子克隆化

为获得所需的基因或特异序列，需 从细胞中分离得到目的基因与载体 DNA重组，并用适当方法在宿主细 胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA片段，称为DNA克隆，亦称 分子克隆。
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基本原理与过程：



1、构建重组DNA：分离纯化目的基因 目的基因 + vector =重组DNA分子 2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其 内增殖。 3、细胞克隆的筛选: 筛选含有重组DNA的细胞— —细胞克隆（cell clone），将转化的细胞至于琼 脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单 个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克 隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA。
4on of a genomic library of human DNA in a bacteriophage λ vector
是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含 COS序列,插入一小plasmid –而得名 Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复 制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外 源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。 可包装30DNA克隆载体
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常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片 段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达 而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β -半乳糖 苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源 基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。
EcoRI HindIII
LacZ
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(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达
真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环 境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特 定基因的表达。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白 的稳定和功ry） 应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部 基因的克隆。
人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（如： DMD gene 2300kb） ，克隆分析就 需要更大的基因载体。如近年来构 建的一些载体：BAC，PI，YAC等。

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1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）



优点：能携带大片段DNA， 约300kb。 在每个细胞中，一个载体 分子能繁殖多个拷贝，高 产DNA。 缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克 隆DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采 用低拷贝数复制子载体， 如，E coli中的F因子。此 质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接 受 >300kbDNA片段。
ligase
重组DNA技术流程简图
host
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重组 DNA 和 分子 克隆 Nhomakorabea34
重组DNA和分子克隆的几种方法：
1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆； 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆

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筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone）


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二、基因运载体及其选择

载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。
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载体具以下特征：
1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿 主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复 制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。
5’ － C T G C A － 3’ G － 3’ 3’ － G 3’ － A C G T C － 5’
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互补末端连接
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产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：
1)用同一种限制酶切割；
2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；
3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘
性末端的限制酶切割。
根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。

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2、限制酶识别序列和切割形式

每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列， 称为限制性位点（restriction sites）或切点。 如：Hare III 5’-GGCC- 3’ 3’-CCGG- 5’
Bam HI 5’-GGATCC-3` 3’-CCTAGG- 5’ 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差
切割形式 粘性末端（sticky end）交错切
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限制性内切核酸酶
HaeⅢ
5’ － G G C C － 3’ 3’ － C C G G － 5’ 5’ － G A T C － 3’ 3’ － C T A G － 5’ 5’ － G G A T C C － 3’ 3’ － C C T A G G － 5’ 5’ － G G 3’ － C C C C － 3’ G G － 5’

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置换λ 载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。 可克隆23kb的外源DNA。 插入载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成 噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可 克隆5kb的cDNA。

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裂 解 途 径
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（三）.粘粒(cosmid vector)
（30~50kb）
Chapter 9 基因操作
（中国医科大学医学遗传学教研室 ）
第一节、重NA多态
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第九章 重点内容提示



基因操作，重组DNA技术,原理,步骤 限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端， 粘末端） 基因载体（vector）,条件，常用载体 基因探针，来源 克隆(clone) 探针标记方法:nick translation (缺口平移)、随机 引物法 DNA多态，RFLP ，VNTR，STR ，微卫星DNA PCR 方法、原理、应用 Southern –Blot:方法、原理、应用 Northern-Blot：方法、原理、应用
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2、噬菌体PI载体和PAC
PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。 内含相当大的（110~115kb）线性DNA， 并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细 胞后环化，扩增。 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生 PI人工染色体克隆系统-----PAC。

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3、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC）
1987G剔除小鼠
1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列
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第一节 重组DNA技术---基因工程
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique） 是人类根据需要选择目的基因（DNA片段） 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。
MboⅠ
5’ － G A T C － 3’ 5’ － － 5’ 3’ － C T A G － 5’ 5’ － G A T C C － 3’ 5’ － G G － 5’ 3’ － C C T A G － 5’
BamHⅠ
PstⅠ
5’ － C T G C A G － 3’ 3’ － G A C G T C － 5’
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目 的 基 因 表 达
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（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌） 中表达
原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接 因子等），因此不能直接表达。 通常采用大肠杆菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列）； 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征： 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2）活性受限或无活性。
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3、特点：
根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断 中的重要用途： 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生 的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的 DNA重组。如人和质粒DNA等。 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶 切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

适用于克 隆大片段 DNA， 0.2~2Mb。
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YAC 的主要功能成份有三：
着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色 体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复 制的复制起点。

构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒， ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分 子，导入酵母细胞克隆。

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一、限制酶
限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链 中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”） 发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

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1、限制酶的命名
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筛查含有目的基因的细胞克隆
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从基因 组中分 离目的 基因在 细胞中 克隆
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四、目的基因表达