基因操作实验讲义

硕士研究生基因操作实验技术实验讲义

实验简介：本实验的目的是将嗜热脂肪芽孢杆菌AS 1411的淀粉酶结构基因（全长1.4kb）采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-amy，重组载体再转化大肠杆菌JM109，重组大肠杆菌可以在IPTG 的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。通过本实验的训练使学生在DNA重组，基因高表达方面得到全面的训练并加深对lac操纵子的理解。

实验一质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定

1.1 实验材料

LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L

LB培养基II ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L

质粒小量快速提取试剂盒（由北京博大泰克公司赞助）

含质粒pLac18的大肠杆菌JM109

台式高速离心机‘水浴锅

1.2 用硅胶膜分离法小量提取质粒

这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于

DNA因此两者很难再被分开。硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。

所有试剂均由试剂盒配套

①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。

②取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。8,000 r/m离心30 s。弃尽上清。

③加入100 L溶液1，彻底悬浮菌体。

④加入150 L溶液2，颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。

⑤加入150 l溶液3，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置

10 min，8,000 r/m离心3 min。

⑥在离心吸附柱中加入结合缓冲液（质粒提取专用）400 l，再将上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000 r/m离心30 s。

⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入500 l漂洗液，8,000 r/m离心30 s，洗去杂质。

⑧倒弃收集管内液体，8,000 r/m离心30 s，除去残留液体。

⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5 mL离心管中，加入75 l 洗脱缓冲液（elution buffer）至管内柱面上，放置10 min。

⑩8,000 r/m离心30 s，所得液体就是立即可用的超纯质粒。

1.3 质粒的酶切与电泳鉴定

质粒的酶切

实验材料

质粒pLac18，上述实验提取

限制性内切酶Eco R I、Hin d III：宝生物工程（大连）有限公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助，包括酶20 U/L，酶反应缓冲液等

实验步骤

1．取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5 L，缓冲液M 2 L，限制性内切酶1 L，混匀。

2．将上述溶液于37 ℃水浴30 min。

酶切产物的电泳

实验材料和仪器

50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 L

TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL

溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解

琼脂糖：华美公司分装Amresco产品

电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）

电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪

凝胶成像仪：美国alpha2200

1．取50 mL小烧杯一个，加入琼脂糖0.14 g，加入TAE缓冲液20 mL，在电炉上煮沸。

2．放置到约50 ℃时，加入溴化乙锭溶液1 L，混匀，倒入制胶槽中，插上制胶梳子。

3．待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽内，拔取制胶梳子。

4．取待检测DNA 4 L，加入0.5 L加样缓冲液，混匀。

5．将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。

6．打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。

7．电泳约50min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。

实验二嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化2.1 实验材料：

Taq DNA聚合酶（含Taq酶Buffer，dNTP）（注：本实验中PCR反应试剂用上海赛百盛公司TaqPremix代替，该产品已经预先加入了水，Taq DNA聚合酶，酶反应缓冲液和dNTP，做PCR反应时只要加入特异性的模板DNA和引物即可），内切酶Bam H I均为大连TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。小量PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物技术公司产品。

2.2 实验步骤

A 淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定

1．取200 µL PCR管一支按顺序加入：

TaqPremix 反应液47µL

引物: 2 µL

嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA 1 µL

94℃变性10 min,

加入Taq DNA聚合酶5个单位。

2．混合后进行PCR反应